广东海洋大学学报 , 2014, 34(6):6-. doi:
摘要:为筛选能在马氏珠母贝外套膜边缘膜与中央膜区域稳定表达的内参基因, 应用荧光定量 PCR技术, 对3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、微管蛋白(TUB)、TATA盒结合蛋白(TBP)、磷脂酶 A2(PLA-2)、葡萄糖苷酶(GUSB)、18S核糖体 rRNA(18SrRNA)等 8个常用的内参基因在马氏珠母贝外套膜边缘膜与中央膜区域的表达情况进行分析, 并利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder软件对 8个内参基因的表达稳定性进行分析。结果表明: 8个内参基因均可获得特异性扩增产物, 但稳定性各异, 其在外套膜边缘膜和中央膜区的表达稳定性顺序依次为 PBGD/TBP>TUB>GUSB>18SrRNA>PLA-2>GAPDH> β-actin; 在荧光定量 PCR中, PBGD和 TBP在马氏珠母贝外套膜边缘膜和中央膜区的表达比较稳定, 为研究贝壳矿化机制中理想的内参基因。
中国水产科学 , 2014, 21(5):910-. doi:10.3724/SP.J.1118.2014.00910
摘要:本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z, CTSZ)、延伸因子1-α(elongation factor 1-α, EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapdh)、β 肌动蛋白(β-actin)6 个候选内参基因在17α, 20β 双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况, 并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析。Bestkeeper 软件分析表明EF-1α 的变异系数和标准差是6 个候选内参基因中最低的, 且Bestkeeper 指数在6 个候选内参基因中最高, 说明其表达稳定性最高, 适合做为内参基因;geNorm 软件分析认为需要同时使用EF-1α 和CTSZ 两个内参基因来校正目标基因的表达;NormFinder 软件分析同样表明EF-1α是6 个候选内参基因中表达最稳定的;最后通过RefFinder 软件综合比较分析, 确定EF-1α 相对于其他5 个候选内参基因, 在17α, 20β 双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定, 可作为内参校正17α, 20β 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况。
水产科学 , 2020, 39(3):306-. doi:10.16378/j.cnki.1003-1111.2020.03.002
摘要:内参基因在实时荧光定量PCR (qRT-PCR)中具有校准的作用,然而鲤疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫内参基因目前仍未见研究报道。采用qRT-PCR技术检测不同处理条件下异育银鲫组织和尾鳍细胞GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4个候选内参基因在组织和尾鳍细胞的转录水平,利用软件geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct分析了其表达量的稳定性,以筛选出健康异育银鲫不同组织以及鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的肾脏、脾脏和异育银鲫尾鳍细胞在不同时间均较稳定的内参基因。geNorm稳定值以及4个内参的表达量Ct值分析显示,健康异育银鲫脑、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠、肝脏和心脏组织中β-actin和EF-1α都是比较稳定的内参基因;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染肾脏和尾鳍细胞不同时间点,内参基因β-actin稳定性最佳;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染脾脏不同时间点时,EF-1α稳定性最佳。分别以4个候选内参基因为内参分析PIN1基因在肾脏组织不同感染时间的相对表达量,结果进一步证实,PIN1基因在肾脏组织感染不同时间点以β-actin为内参时,其表达量呈下降趋势,与cDNA文库测序中的表达量分析结果一致,各时间点的表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果有利于研究异育银鲫在不同处理条件下基因的表达分析,可为获得精准的结果奠定理论基础。
广东海洋大学学报 , 2018, 38(5):8-. doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2018.05.002
摘要:[目的]筛选多鳞鱚(Sillago sihama)雌雄不同组织中稳定表达的内参基因。[方法]应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术定量分析多鳞鱚snrpd1rps27rpl7arpl7cnpbrps4rps20ef1aube2rplp2等10个候选内参基因mRNA在雌、雄个体脑、鳃、性腺、心、肠、肾、肝、肌肉、皮肤、脾、胃等22个组织中的表达水平,通过BestKeeper、NormFinder、GeNorm工具测评10个内参基因表达的稳定性。[结果]10个候选内参基因均可获得特异性的扩增产物和理想的扩增效率,其中Bestkeeper软件计算候选内参基因稳定性由高到低的顺序为:snrpd1 = rps27 > rpl7a > rpl7 > cnpb = rps4 > rps20 > ef1a > ube2 > rplp2;NormFinder软件分析结果为:rpl7 > rpl7a > rps27 > rps4 > cnpb > ef1a > rps20 > ube2 > rplp2 > snrpd1;GeNorm软件分析结果为:rpl7/rpl7a > rps4 > ef1a > rps27 > rps20 > cnpb > ube2 > rplp2 > snprd1。[结论]rpl7rpl7arps27基因的表达稳定性较高,建议选择rpl7rpl7a共同作为多鳞鱚qRT-PCR研究的内参基因。
广东海洋大学学报 , 2018, 38(1):7-. doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2018.01.002
摘要:[目的]筛选光裸星虫体壁、肠道、肾管、吻、收吻肌以及体腔液细胞中稳定表达的内参基因。[方法]应用荧光定量PCR技术,对GAPDHβ-actinTUBTBP以及UBC等常用内参基因的表达情况进行分析,通过geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线内参筛选工具RefFinder对8个内参基因表达稳定性进行评测。[结果]8个内参基因均可获得特异性扩增产物,但稳定性各异。通过累计积分法综合了4个软件给出的稳定性排序结果,候选内参基因表达稳定性综合排名为TBP(1)> TBP(2)> UBC > GAPDH > TUB(2)> TUB(1)> β-actin(2)> β-actin(1)。[结论]TBP(1)在光裸星虫全组织中的表达最稳定,可作为最适单内参基因。
集美大学学报(自然科学版) , 2018, 23(2):91-. doi:
摘要:内参基因的稳定性对实时定量PCR的结果影响巨大。采用GeNorm、normFinder和RefFinder三款软件比较了鲍变态和干扰幼虫甲状腺激素受体(TR)两种情况下内参基因的稳定性。软件分析了EIF5AOAZ1YB1RPL3RPS9ACT等6个候选内参基因的Ct值,据此获得各基因的稳定值。在杂色鲍幼虫的变态过程中,EIF5A稳定性最高,排名平均数为1,表明该基因可以作为这一阶段实时定量PCR的内参基因,但是在干扰TR情况下,EIF5A的稳定性下降,排名平均数为3.91。RPS9则与之相反,在变态过程该基因表达稳定性最差,而在干扰TR时表达稳定性最好。ACT在两种情况下稳定性较好,排名平均数均位列第二位,可以作为这两种情况下的通用内参基因。其他基因的稳定性在这两种情况下也发生剧烈变换。这表明内参基因的稳定与样品具体处理情况关系密切。为了保证定量PCR结果的准确性,需要针对具体处理情况相应地进行内参基因的稳定性评估。
广东海洋大学学报 , 2019, 39(6):30-. doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.005
摘要:[目的] 筛选对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)有抑菌作用的中草药及其复方以及抗生素。[方法] 采用改良的牛津杯法对诃子、白芍、甘草等49种单味中药进行溶藻弧菌体外抑菌试验,以体外抗菌活性较好的22种药物,按中药配伍规则组成二联、三联复方,采用生药质量浓度分别为60、240 mg/mL的中药进行中药复方体外抑菌试验。用抗生素对溶藻弧菌进行药敏试验。[结果] 当单种中药体外抑菌药物质量浓度为240 mg/mL时,诃子、乌梅、醋五味子等对溶藻弧菌抑菌作用明显,为极敏感。在二联中药体外抑菌试验中,当中药质量浓度为60 mg/mL时,诃子、乌梅组成复方中药等8种复方对溶藻弧菌协同抑菌作用明显,为极敏感,药物质量浓度在240 mg/mL时,诃子与白芍等14种双联中药的协同抑菌作用明显,为极敏感。在三联中药体外抑菌试验中,在药物质量浓度60 mg/mL时,诃子、乌梅、蒲公英等组成24种复方中药按质量比1:1:1的抑菌效果极为敏感,药物质量浓度在240 mg/mL时,黄芩、诃子、黄芪等22复方中药按质量比1:1:1对的抑菌作用明显,为极敏感。溶藻弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、土霉素及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑4种药物高度敏感。[结论] 18种单味中药对溶藻弧菌有抑制作用,黄芩、诃子、黄芪等24个三联复方中药药效较强,多个抑菌作用效果良好的三联复方中药可用于鱼病防治研究。
大连海洋大学学报 , 2019, 34(3):370-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2019.03.010
摘要:为筛选能够稳定表达的内参基因用于尖裸鲤Oxygymnocypris stewarti实时荧光定量PCR分析,以尖裸鲤血液、心脏、肝、脾、鳃、头肾、中肾、后肾、前肠、中肠、后肠、性腺、眼、垂体、脑、红肌、白肌和皮肤18个组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、HPRT1(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1)、RPL13(核糖体蛋白L13)、RPL19(核糖体蛋白L19)、RPL13a(核糖体蛋白L13a)、SDHA(琥珀酸脱氢酶亚基A)和ACTB(β-肌动蛋白)7个候选内参基因的表达情况,并采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行分析。结果表明:GeNorm分析显示,7个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为RPL13=RPL13a < RPL19 < GAPDH < ACTB < SDHA < HPRT1,其中RPL13和RPL13aM值均最小(0.62);NormFinder分析显示,7个候选内参基因的M值依次为RPL13 < RPL13a < RPL19 < GAPDH < ACTB < SDHA < HPRT1,其中RPL13的M值最小(0.30);BestKeeper分析显示,7个候选内参基因的标准差(S.D.)依次为RPL13 < RPL19 < GAPDH < HPRT1 < RPL13a < SDHA < ACTB,变异系数(CV)值依次为RPL13 < RPL19 < HPRT1 < GAPDH < SDHA < RPL13a < ACTB,其中RPL13的标准差(0.84)和变异系数(4.54%)均最小;7个候选内参基因在尖裸鲤不同组织中的表达量存在差异。研究表明,7个内参基因中RPL13的表达较为稳定,可作为尖裸鲤实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因,本研究结果可为尖裸鲤遗传学及分子生物学等研究提供基础数据。