中国水产科学 , 2016, 23(5):1041-. doi:10.3724/SP.J.1118.2016.16043
摘要:本研究运用同源克隆技术和RACE技术克隆了栉江珧(Atrina pectinatawnt4基因cDNA全长序列。该基因序列全长为1493 bp,其中开放阅读框1074 bp,编码由357个氨基酸组成的蛋白。氨基酸序列分析表明,栉江珧wnt4基因具有wnt家族保守结构域,与栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海胆(Paracentrotus lividus)等物种具有高度的同源性。荧光定量PCR分析表明,wnt4基因表达具有广泛性和组织差异性,且与性别和性腺繁殖周期相关。wnt4基因表达量与性腺成熟度相关,并且整个繁殖周期卵巢表达量均显著高于精巢,说明wnt4基因参与了栉江珧两性性腺的发育,并在卵巢中发挥更重要的作用。不同发育阶段胚胎荧光定量分析表明,wnt4基因主要参与了栉江珧的早期胚胎发育。在胚胎发育早期(囊胚期和原肠期)wnt4基因的表达水平最高,是成体表达量的500倍;在担轮幼虫和D形幼虫期迅速下降,暗示wnt4基因可能在栉江珧早期发育阶段参与了某些器官的形成。17β-雌二醇诱导实验显示,17β-雌二醇可能通过反馈调节抑制卵巢wnt4基因表达(P<0.05);短时间处理,17β-雌二醇能诱导精巢wnt4基因显著表达(P<0.05)。
渔业科学进展 , 2017, 38(6):148-. doi:10.11758/yykxjz.20160711002
摘要:运用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术,测定了一种核酸内非组蛋白类蛋白HMG (High-mobility group box protein)在刺参肠道再生第30分钟、1、2、6小时、1、3、7天的mRNA表达情况,结果显示,再生第6小时之前,表达量与正常刺参肠道相比无显著变化,再生第1-7天,其表达量显著高于对照组,并于第7天达到最大值。采用免疫荧光技术,分析测定了HMG在刺参肠道再生各时期的蛋白表达情况,结果显示,再生第2、6小时,HMG蛋白荧光信号弱,仅在浆膜层和黏膜层有少量分布;再生第1-7天,HMG蛋白荧光信号逐渐增强,再生第1天的HMG荧光主要分布在浆膜层和肌肉层,再生第3天和第7天的荧光信号最强,各层均有分布。结合HMG在其他物种组织修复再生中的作用,推测HMG可使免疫系统识别损伤信号,启动修复再生功能,调控细胞外基质(ECM)成分的降解与生成,诱导干细胞迁移、分化,并可能在伤口愈合阶段过后参与细胞免疫。
水产学报 , 2016, 40(6):856-. doi:10.11964/jfc.20151010106
摘要:采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(SbCAT)基因cDNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。SbCAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,SbCAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,SbCAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了SbCAT的组织表达特征。结果显示,SbCAT mRNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,SbCAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。
水产学报 , 2018, 42(12):1857-. doi:10.11964/jfc.20170610881
摘要:为明确石磺钙通道蛋白1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)基因和蓝尼碱受体(RyR)基因的序列和结构信息,初步研究不同石磺中的Onchidium struma-IP3R/Onchidium struma-RyR (Os-IP3R/Os-RyR)基因表达量百分比与石磺系统进化的相关性,实验在瘤背石磺表皮转录组数据库的基础上,克隆得到2条钙通道蛋白基因Os-IP3ROs-RyR,利用生物信息学技术对该基因及所编码蛋白的结构特征进行分析,并通过qRT-PCR技术分析2个基因在瘤背石磺、平疣桑椹石磺和紫色疣石磺各组织中的表达情况。结果显示,Os-IP3R核酸序列为4 574 bp,包括2 808 bp的开放阅读框,共编码935个氨基酸,预测编码的蛋白有6个跨膜区;Os-RyR核酸序列为1 253 bp,包括1 131 bp的开放阅读框,共编码376个氨基酸,预测编码的蛋白有3个跨膜区。将瘤背石磺IP3R和RyR的氨基酸序列进行比对,发现位于钙离子通道区的G*R*GGG*GD序列处高度保守;发现3种石磺Os-IP3R/Os-RyR 的相对表达百分比的高低顺序与各石磺从陆地到浅海的梯度分布趋势相一致,依次为瘤背石磺>平疣桑椹石磺>紫色疣石磺;石磺的陆栖性越强,则Os-IP3R/Os-RyR 的相对表达百分比越高。不同种石磺的Os-IP3R/Os-RyR表达量百分比的研究能为分析海洋无脊椎动物由海洋向陆地进化学说提供新的分子生物学线索。
南方水产科学 , 2016, 12(2):36-. doi:10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.006
摘要:基础转录因子ⅡH亚基4(general transcription factor ⅡH subunit 4,GTF2H4)作为基础转录因子ⅡH(TFⅡH)的重要组成成员对真核生物转录过程中所涉及的细胞生长、发育、代谢等具有重要调控作用。该研究以斑节对虾(Penaeus monodon)为研究对象,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplication of cDNA ends,RACE)获得了PmGTF2H4基因的cDNA全长。该序列全长1 401 bp,可编码466个氨基酸,其中包括108 bp的5'非编码区域(UTR)和372 bp的3'UTR。同源性分析显示,PmGTF2H4与阿里山潜蝇茧蜂(Fopius arisanus)等物种的GTF2H4具有较高的同源性。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,PmGTF2H4在斑节对虾卵巢中的表达量显著高于其他组织;在卵巢的5个不同发育时期中,PmGTF2H4在Ⅴ期的表达量最高,在Ⅰ期的表达量最低。注射五羟色胺(5-HT)后发现PmGTF2H4的表达水平在6~48 h显著上调。通过上述研究结果可以预测PmGTF2H4基因参与了斑节对虾卵巢的发育,并起了一定的作用。
渔业科学进展 , 2020, 41(2):150-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20190215001
摘要:为筛选适用于研究地榆(Sanguisorba officinalis L.)对对虾急性肝胰腺坏死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus, VPAHPND)抑制机理的内参基因,本文探究了地榆醇提物胁迫下VPAHPND生长的变化,并利用qRT-PCR技术探究了该条件下VPAHPND中6种常见内参基因(rec Apvs Apvu Agapdh16S rRNArpo S)的表达情况,利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。结果显示,地榆醇提物能抑制VPAHPND的生长,且抑制效果与浓度呈正相关。在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这6种内参基因扩增产物特异性良好,其中,Ct值变化差异最小的为16S rRNA(CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A (CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中,GeNorm给出的稳定性排序为rpo S=16S rRNA > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Norm Finder结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Best Keeper结果为16S rRNA > rpo S > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Delta Ct结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo S > gapdh > 16S rRNA > pvu A > pvs A > rec A。本研究根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo Sgapdh作为该条件下内参基因。本研究为以地榆为核心药物的AHPND防控技术的建立和从基因表达角度研究地榆对VPAHPND的作用机理提供了基础。
中国水产科学 , 2020, 27(9):1021-. doi:10.3724/SP.J.1118.2020.20023
摘要:细胞色素c氧化酶(COX)是线粒体电子传递链的末端酶,COX6A是细胞色素c氧化酶的核编码亚基之一。为丰富花鲈(Latolabrax maculatus)细胞色素c氧化酶的基础研究,进一步了解cox6a基因及相关miRNAs在花鲈渗透调节机制中的潜在作用,本研究开展了花鲈cox6a基因的全基因组鉴定及序列分析、cox6a基因的组织表达谱分析和急性盐度转换后的表达分析。此外,预测了可能靶定花鲈cox6a基因的miRNAs,并对其与cox6a基因的功能相关性进行了分析。结果表明,花鲈具有2个cox6a基因(cox6a1、cox6a2)。系统进化树分析进一步确认了两个花鲈cox6a基因命名的准确性。多序列比对表明cox6a基因具有高度的保守性,尤其是C端。组织表达谱结果显示,花鲈cox6a1在垂体、脑、肝脏和肾脏中的表达量较高,cox6a2在心脏和肾脏中的表达量较高。共获得4个可能靶定cox6a2基因的miRNA:miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p和miR-155-5p,但没有发现可能靶定cox6a1基因的miRNA。qRT-PCR的结果显示,在花鲈适应低盐和高盐环境的过程中,cox6a1、cox6a2基因以及miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p都呈现显著差异表达,而miR-155-5p仅在适应高盐环境时出现了显著的差异表达。这表明,cox6a1、cox6a2基因和4个miRNAs在花鲈的渗透调节过程中发挥潜在作用。其中miR-30e-5p、miR-223和miR-200a-3p的表达趋势与cox6a2呈负相关关系,以miR-223相关性最高。由此推测,miR-30e-5p、miR-223和miR-200a-3p不同程度地参与了cox6a2基因的表达调控。本研究为探讨花鲈适应不同盐度环境的渗透调节机制提供了基础数据。
水产学报 , 2016, 40(10):1556-. doi:10.11964/jfc.20150509890
摘要:为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长cDNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的cDNA全长,命名为HsCtsL1-like基因(GenBank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5'-非翻译区(5'UTR)为31 bp,3'-非翻译区(3'UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,HsCtsL1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的CtsL签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在HsCtsL1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏CtsL1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌CtsL(ADV03094)和池蝶蚌中另一个CtsL(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,HsCtsL1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的CtsL1聚为一分支,推测HsCtsL1-like属于CtsL家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测显示,HsCtsL1-like mRNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏HsCtsL1-like mRNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。
水产学报 , 2020, 44(4):1-. doi:10.11964/jfc.20190311710
摘要:以条斑紫菜转录组测序筛选得到的差异性表达基因(Contig-21827)序列为基础,采用RT-PCR技术克隆得到了条斑紫菜单孢子形成相关基因PyMFG的完整开放阅读框。对其进行序列分析发现,PyMFG基因的ORF全长为1 224 bp,编码一个包含407个氨基酸的多肽片段,其分子量为46.24 ku,等电点为9.08。结构域分析结果显示,该蛋白含有保守的TEA结构域和YAP结构域,属于TEA-ATTS超家族结构域。通过多序列比对和系统进化分析发现,该蛋白与真菌分生孢子形成蛋白聚为一个大的分支,亲缘关系较近。此外,不同品系间的单孢子放散能力和qRT-PCR分析结果显示,PyMFG基因在PY26WPY26W'品系中的表达趋势与宏观统计结果高度一致,在PY26RPY26R'品系中的表达则与统计结果存在差异。由此推断,父本(PY26W)/偏父本品系(PY26W')中调控单孢子形成、放散的相关基因种类和具体分子机制与母本(PY26R)/偏母本品系(PY26R')存在差异,因而导致单孢子的宏观统计结果与荧光定量结果存在差异。
水产学报 , 2017, 41(7):1064-. doi:10.11964/jfc.20160810518
摘要:为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBCTUB、18SEF2、ACTGAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、GeNorm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;geNorm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBCEF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。