水产学报 , 2016, 40(6):856-. doi:10.11964/jfc.20151010106
摘要:采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(SbCAT)基因cDNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。SbCAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,SbCAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,SbCAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了SbCAT的组织表达特征。结果显示,SbCAT mRNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,SbCAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。
大连海洋大学学报 , 2011, 26(6):507-. doi:
摘要:根据已知的绿沙蚕Nereis virens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857 bp, 5'端非翻译区为186 bp, 3'端非翻译区为225 bp,阅读框为1446 bp,编码为481个氨基酸。第422~431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319~322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282~294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTT。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对, CYP4与多毛类绿沙蚕Nereis virens CYP4BB1、CYP342A1(AY453408)氨基酸同源性为73%、36%,与多毛类小头虫Capitella capitata CYP4AT1(AY574044)同源性为39%。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。
渔业科学进展 , 2018, 39(4):152-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20170407001
摘要:本研究以海带(Saccharina japonica)‘海天1号’为材料,通过RACE-PCR方法获得海带hsp70Sjhsp70)基因全长cDNA序列。序列分析表明,全长cDNA长度为3778 bp,含有1个2892 bp的开放阅读框,5'和3'非编码区的长度分别为101、785 bp。蛋白质氨基酸含量和理化性质分析显示,该蛋白为稳定蛋白。应用BLASTP程序对不同物种HSP70蛋白比较分析表明,海带与长囊水云(Ectocarpus siliculosus)的HSP70蛋白具有较高的同源性,用HSP70蛋白构建的进化树显示,海带与长囊水云聚为一类。二级结构预测该蛋白由963个氨基酸组成,包含35个α螺旋和25个β折叠。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HSP110蛋白三维结构3C7N为模板,在I-TASSER软件上预测海带HSP70蛋白的三维结构,预测的蛋白结构与3C7N的A链在折叠和二级结构方面非常类似。对Sjhsp70基因在温度胁迫下表达变化分析表明,高温对Sjhsp70的表达量具有显著影响,Sjhsp70在25℃、24 h胁迫条件时,表达量达到最大值。本研究为阐明海带HSP70蛋白特性及其应对环境胁迫的机理提供理论依据。
大连海洋大学学报 , 2014, 29(4):329-. doi:10.3969/J.ISSN.2095-1388.2014.04.002
摘要:采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1(GenBank:HQ259110),并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明:SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠;SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725~750位有跨膜区,发现1个信号肽(1~32aa)、1个亮氨酸重复富集区(LRR);SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌(P<0.05);经V.fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h时略有升高。研究表明,TLR基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。
水产学报 , 2017, 41(5):658-. doi:10.11964/jfc.20160810503
摘要:为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。
中国水产科学 , 2016, 23(2):316-. doi:10.3724/SP.J.1118.2016.15229
摘要:通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1922 bp,其中5'UTR 266 bp, 3'UTR 360 bp, ORF1296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 kD,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示, Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P<0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P<0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P<0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。
中国水产科学 , 2011, 18(1):38-. doi:10.3724/SP.J.1118.2011.00038
摘要:天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白。本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp 基因并进行了表达分析。该基因cDNA 序列全长为3 158 bp, 编码1 个含544 个氨基酸的蛋白。该蛋白含有Nramp 家族的特征序列: 包含12 个跨膜区(TM)、1 个由20 个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM)。草鱼Nramp 同其他16 个物种的Nramp 氨基酸序列同源性在62.5%~90.2%之间。草鱼Nramp基因cDNA 的独特结构是其3′末端非翻译区(UTR)和5′UTR 各有1 个脊椎动物Nramp2 中的铁反应控制蛋白结合位点(IRE)。系统进化分析表明, 草鱼Nramp 和所有鱼类Nramp 聚为一簇, 与哺乳类Nramp2 的亲缘关系较近。Nramp 基因在草鱼头肾和脾脏中的表达量最高, 在肌肉和皮肤中的表达量最低, 在草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾脏细胞系(CIK)中的表达量明显升高。[中国水产科学, 2011, 18(1): 3847]
广东海洋大学学报 , 2013, 33(3):46-. doi:
摘要:白细胞介素 6(IL-6)是一个多效的细胞因子, 在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象, 采用 RT-PCR和 Smart RACE 技术克隆获得草鱼 IL-6(CiIL-6)cDNA序列, CiIL-6的 cDNA全长为 1 145 bp, 包含一个长为 702 bp的开放阅读框, 能编码 233个氨基酸, 预测 CiIL-6的蛋白质分子质量为 26.74 ku, 等电点为8.72。其中 5 ' 和3' 非编码区(UTR)分别为 86 bp和 357 bp。氨基酸同源性分析显示, 草鱼和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近, 它们的 CiIL-6氨基酸同源性高达 76%, 而与其他物种的同源性均低于30%。RT-PCR的结果显示, CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高, 而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。
上海海洋大学学报 , 2011, 20(3):342-. doi:
摘要:以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5'端非翻译区123 bp,3'端非翻译区526 bp,开放阅读框(ORF)长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔(Aplysia californica)theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2~22、57~62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。