渔业研究 , 2020, 42(2):105-. doi:10.14012/j.cnki.fjsc.2020.02.002
摘要:定量PCR技术已经成为基因表达水平测定最常用的方法,选择合适的内参基因对基因表达水平的准确定量至关重要。本文检测了菊黄东方鲀β-actin、GAPDH、EF1-α和18S rRNA等4种内参基因在不同组织、生长环境和发育阶段中的表达,应用3种内参基因筛选软件(geNorm、NormFinder和Bestkeeper)综合分析了这4种内参基因表达的稳定性。结果表明内参基因在成鱼养殖和野生菊黄东方鲀内的稳定性排名均为:EF1-α > β-actin > 18S rRNA > GAPDH;在养殖菊黄东方鲀3月龄、6月龄和12月龄三个发育阶段中内参基因EF1-α最稳定,其他各组织在不同发育阶段内参基因的选择有所差异。研究结果为不同条件下菊黄东方鲀功能基因表达的定量分析提供重要参考。
渔业科学进展 , 2020, 41(2):150-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20190215001
摘要:为筛选适用于研究地榆(Sanguisorba officinalis L.)对对虾急性肝胰腺坏死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus, VPAHPND)抑制机理的内参基因,本文探究了地榆醇提物胁迫下VPAHPND生长的变化,并利用qRT-PCR技术探究了该条件下VPAHPND中6种常见内参基因(rec Apvs Apvu Agapdh16S rRNArpo S)的表达情况,利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。结果显示,地榆醇提物能抑制VPAHPND的生长,且抑制效果与浓度呈正相关。在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这6种内参基因扩增产物特异性良好,其中,Ct值变化差异最小的为16S rRNA(CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A (CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中,GeNorm给出的稳定性排序为rpo S=16S rRNA > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Norm Finder结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Best Keeper结果为16S rRNA > rpo S > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Delta Ct结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo S > gapdh > 16S rRNA > pvu A > pvs A > rec A。本研究根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo Sgapdh作为该条件下内参基因。本研究为以地榆为核心药物的AHPND防控技术的建立和从基因表达角度研究地榆对VPAHPND的作用机理提供了基础。
南方水产科学 , 2013, 9(6):33-. doi:10.3969/j.issn.2095-0780.2013.06.006
摘要:以合浦珠母贝(Pinctada fucata)为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体rRNA(18S rRNA)3个管家基因在合浦珠母贝不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期mRNA水平的表达情况。同时比较了BestKeeper、geNorm和NormFinde软件对试验数据处理的差异,从中选出合适的内参基因。结果表明β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定,18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。
中国水产科学 , 2014, 21(5):910-. doi:10.3724/SP.J.1118.2014.00910
摘要:本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z, CTSZ)、延伸因子1-α(elongation factor 1-α, EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapdh)、β 肌动蛋白(β-actin)6 个候选内参基因在17α, 20β 双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况, 并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析。Bestkeeper 软件分析表明EF-1α 的变异系数和标准差是6 个候选内参基因中最低的, 且Bestkeeper 指数在6 个候选内参基因中最高, 说明其表达稳定性最高, 适合做为内参基因;geNorm 软件分析认为需要同时使用EF-1α 和CTSZ 两个内参基因来校正目标基因的表达;NormFinder 软件分析同样表明EF-1α是6 个候选内参基因中表达最稳定的;最后通过RefFinder 软件综合比较分析, 确定EF-1α 相对于其他5 个候选内参基因, 在17α, 20β 双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定, 可作为内参校正17α, 20β 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况。
水产学报 , 2017, 41(7):1064-. doi:10.11964/jfc.20160810518
摘要:为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBCTUB、18SEF2、ACTGAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、GeNorm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;geNorm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBCEF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。
水产学报 , 2018, 42(5):663-. doi:10.11964/jfc.20170110688
摘要:为筛选出菲律宾蛤仔17个发育时期及成体7个组织中的最适内参基因,实验采用3个内参基因筛选方法geNorm、NormFinder及ΔCt对菲律宾蛤仔不同发育时期和成体不同组织中的12个候选内参基因延伸因子1α基因(EF1A)、TATA盒结合蛋白基因(TBP)、组蛋白H3基因(HIS)、细胞色素b5基因(CYTB5)、泛素缀合酶基因(UCE)、核糖体蛋白L8基因(RPL8)、核糖体蛋白S23基因(RPS23)、核糖体蛋白L2基因(RPL2)、细胞色素C基因(CYTC)、生长因子受体结合蛋白2基因(GFRP2)、肌动蛋白基因(ACT)和微管蛋白基因(TUB)进行表达稳定性分析。结果显示,菲律宾蛤仔不同发育时期qRT-PCR分析需要3个内参基因,分别为CYTCCYTB5和RPS23;菲律宾蛤仔成体不同组织qRT-PCR分析需要2个内参基因,分别为CYTB5和GFRP2。ACT在菲律宾蛤仔不同发育阶段和不同组织中表达最不稳定。
中国水产科学 , 2020, 27(7):759-. doi:10.3724/SP.J.1118.2020.19295
摘要:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是基因表达研究的常用方法,筛选达氏鲟(Acipenser dabryanus)稳定表达的内参基因,是保证该物种基因表达qRT-PCR分析结果准确性的基础。本研究选取了达氏鲟β肌动蛋白(β-actin)、延伸因子1α(EF-1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L8(RPL8)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、琥珀酸脱氢酶复合物A亚基(SDHA)和α微管蛋白(α-tubulin)共7个常用内参基因作为候选基因,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4个软件分析这7个候选基因在达氏鲟成鱼不同组织和不同发育时期胚胎及性腺的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因的定量PCR引物均可获得特异性扩增产物和理想的扩增效率。在成鱼不同组织中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为EF-1α > β-actin > SDHA > RPL8 > 18S rRNA > α-tubulin > GAPDH;在不同发育时期胚胎中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为EF-1α > β-actin > SDHA > α-tubulin > 18S rRNA > GAPDH > RPL8;在不同发育时期精巢中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为EF-1α > RPL8 > β-actin > SDHA > 18S rRNA > α-tubulin > GAPDH;在不同发育时期卵巢中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为RPL8 > EF-1α > SDHA > β-actin=α-tubulin > 18S rRNA > GAPDH。因此,达氏鲟成鱼不同组织、不同发育时期胚胎和精巢最稳定表达内参基因是EF-1α,而不同发育卵巢最稳定表达的内参基因是RPL8。本研究旨在为今后达氏鲟不同组织、不同发育时期胚胎及性腺的基因表达差异研究提供理论基础。
水产科学 , 2020, 39(3):306-. doi:10.16378/j.cnki.1003-1111.2020.03.002
摘要:内参基因在实时荧光定量PCR (qRT-PCR)中具有校准的作用,然而鲤疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫内参基因目前仍未见研究报道。采用qRT-PCR技术检测不同处理条件下异育银鲫组织和尾鳍细胞GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4个候选内参基因在组织和尾鳍细胞的转录水平,利用软件geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct分析了其表达量的稳定性,以筛选出健康异育银鲫不同组织以及鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的肾脏、脾脏和异育银鲫尾鳍细胞在不同时间均较稳定的内参基因。geNorm稳定值以及4个内参的表达量Ct值分析显示,健康异育银鲫脑、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠、肝脏和心脏组织中β-actin和EF-1α都是比较稳定的内参基因;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染肾脏和尾鳍细胞不同时间点,内参基因β-actin稳定性最佳;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染脾脏不同时间点时,EF-1α稳定性最佳。分别以4个候选内参基因为内参分析PIN1基因在肾脏组织不同感染时间的相对表达量,结果进一步证实,PIN1基因在肾脏组织感染不同时间点以β-actin为内参时,其表达量呈下降趋势,与cDNA文库测序中的表达量分析结果一致,各时间点的表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果有利于研究异育银鲫在不同处理条件下基因的表达分析,可为获得精准的结果奠定理论基础。
水生生物学报 , 2020, 44(1):180-. doi:10.7541/2020.021
摘要:为研究苯酚胁迫下多刺裸腹溞(Moina macrocopa)相关基因的表达情况, 筛选用于实时定量PCR分析的最佳内参基因。利用内参基因表达的cycle threshold(Ct值)非参数检验、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四种方法对β-actin、16S rRNA和12S rRNA进行分析, 筛选出苯酚胁迫下多刺裸腹溞表达相对稳定的内参基因。结果显示, 从Ct值初步判定不同浓度苯酚胁迫后, 多刺裸腹溞体内β-actin、16S rRNA和12S rRNA均可稳定表达, 且稳定性顺序为: 16S rRNA>12S rRNA>β-actin, 从GeNorm软件分析显示内参基因的稳定性顺序为: 16S rRNA=β-actin>12S rRNA, NormFinder和Bestkeeper分析显示的稳定性顺序均为: 16S rRNA>β-actin>12S rRNA。基于以上四种方法对三个候选内参基因的筛选, 确定了16S rRNA作为多刺裸腹溞实时定量PCR的最佳内参基因, 有助于提高qRT-PCR分析的准确性, 为进一步研究苯酚胁迫多刺裸腹溞后目的基因功能的表达提供了基础。
广东海洋大学学报 , 2018, 38(5):8-. doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2018.05.002
摘要:[目的]筛选多鳞鱚(Sillago sihama)雌雄不同组织中稳定表达的内参基因。[方法]应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术定量分析多鳞鱚snrpd1rps27rpl7arpl7cnpbrps4rps20ef1aube2rplp2等10个候选内参基因mRNA在雌、雄个体脑、鳃、性腺、心、肠、肾、肝、肌肉、皮肤、脾、胃等22个组织中的表达水平,通过BestKeeper、NormFinder、GeNorm工具测评10个内参基因表达的稳定性。[结果]10个候选内参基因均可获得特异性的扩增产物和理想的扩增效率,其中Bestkeeper软件计算候选内参基因稳定性由高到低的顺序为:snrpd1 = rps27 > rpl7a > rpl7 > cnpb = rps4 > rps20 > ef1a > ube2 > rplp2;NormFinder软件分析结果为:rpl7 > rpl7a > rps27 > rps4 > cnpb > ef1a > rps20 > ube2 > rplp2 > snrpd1;GeNorm软件分析结果为:rpl7/rpl7a > rps4 > ef1a > rps27 > rps20 > cnpb > ube2 > rplp2 > snprd1。[结论]rpl7rpl7arps27基因的表达稳定性较高,建议选择rpl7rpl7a共同作为多鳞鱚qRT-PCR研究的内参基因。