中国水产科学 , 2014, 21(3):432-. doi:10.3724/SP.J.1118.2014.00432
摘要:为揭示Toll样受体家族基因TLR9在鲫(Carassius auratus L.,缩写为Ca)免疫过程中的作用,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了鲫TLR9(CaTLR9)基因cDNA,并就注射外源性人绒毛膜促性激素(hCG)和不同性腺周期对该基因在鲫肠道表达的影响进行了分析.结果表明,CaTLR9 cDNA全长3 509 bp,包含3 195 bp的开放阅读框(ORF)、72 bp的5′非编码区和242 bp的3′非编码区.ORF编码1 064个氨基酸组成的蛋白质.该蛋白包含19个氨基酸组成的信号肽,15个富含亮氨酸的重复结构域(LRR),1个跨膜区和1个TIR结构域.系统进化分析表明,CaTLR9与其他鲤科鱼类同源性较高,与鲤(Cyprinus carpio)相似度为92%,其次是草鱼(Ctenopharyngodon idella)和斑马鱼(Danio rerio),分别为 83%和79%.实时荧光定量PCR结果表明,CaTLR9在鲫脾中表达量最高,其次为肾和鳃,其他组织的表达量均较低.鲫肠道TLR9在非繁殖期的表达水平明显低于繁殖期,注射适当剂量的外源hCG可显著上调鲫肠道TLR9的表达.本研究对揭示鲫非特异性免疫能力调节机制,提高鲫健康养殖水平具有一定参考价值.
中国水产科学 , 2014, 21(5):863-. doi:10.3724/SP.J.1118.2014.00863
摘要:生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45, Gadd45)基因在胚胎发育和性别决定中起重要作用。本研究通过RACE 方法在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到了1 个Gadd45g 同源基因, 命名为Gadd45g3。该基因全长1 147 bp, 编码155 个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明, 半滑舌鳎Gadd45g3 与其他鱼类 Gadd45g-like 的同源性为79%~88%, 与硬骨鱼和高等脊椎动物的Gadd45g 同源性为58%~67%。对多个物种的Gadd45g 同源基因的CDS 区进行Ka/Ks 分析, 发现Ka/Ks 均小于0.3。FISH 结果显示, 半滑舌鳎Gadd45g3 基因位于常染色体上。实时荧光定量PCR 结果显示, Gadd45g3在雌雄成鱼的脑中都有很高的表达, 说明其参与了神经发育;在成熟性腺中, Gadd45g3 的表达具有精巢特异性, 说明Gadd45g3 是性别相关基因;而在不同发育时期的性腺中, Gadd45g3 的表达量在孵化后20 d 的雄性仔鱼中显著高于同龄雌鱼(P<0.05), 但在孵化后95 d 的雌雄仔鱼中均有高表达, 说明在半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起着重要作用。
水产学报 , 2018, 42(8):1169-. doi:10.11964/jfc.20170910963
摘要:为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp (GenBank ID: MF926270),包含132 bp 5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Real-time PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。
广东海洋大学学报 , 2019, 39(2):1-. doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2019.02.001
摘要:[目的]分析金钱鱼(Scatophagus argus)卵巢发育过程重要基因——合子阻滞因子1(Zygote arrest 1,Zar1)组织表达及其在卵子成熟和胚胎发育过程中的表达。[方法]克隆金钱鱼Zar1基因,采用反转录-PCR (RT-PCR)检测其在各组织的分布情况,实时荧光定量PCR (qPCR)研究Zar1在不同卵巢发育时期和胚胎发育过程中的表达。[结果]金钱鱼Zar1的开放阅读框(ORF)序列全长为1 008 bp,编码335个氨基酸。序列分析发现,金钱鱼Zar1在蛋白C末端高度保守,具有非典型的PHD基序(Plant homeo domain)和锌指结构域。金钱鱼Zar1同源性分析发现,它与鲈形目物种相似度最高,其中大黄鱼(Larimichthys crocea)相似性最高,为85.1%。系统进化树分析显示,金钱鱼Zar1与大黄鱼亲缘关系最近,与其分类地位一致。组织分布发现,金钱鱼Zar1仅在卵巢中表达。Zar1在Ⅱ、Ⅲ和IV期卵巢表达呈现逐渐递增趋势,其中IV期表达水平显著高于Ⅱ期卵巢。Zar1在胚胎发育早期表达较高,后期较低,其中在四细胞期表达水平最高,之后逐渐降低。[结论]金钱鱼Zar1在卵巢和胚胎期表达,在金钱鱼卵子发生和胚胎发育阶段发挥重要作用。
广东海洋大学学报 , 2017, 37(3):8-. doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2017.03.002
摘要:克隆并鉴定墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)的一种c型溶菌酶基因(Fm-Lyz),其cDNA全长为770 bp,包括71 bp的5'非编码区(UTR)、222 bp的3' UTR和477 bp完整开放阅读框,编码158个氨基酸。SMART分析显示,Fm-Lyz氨基酸序列包含1个LYZ1结构域和1个含18个氨基酸的信号肽。同源性分析发现,Fm-Lyz与斑节对虾(Penaeus monodon)溶菌酶同源性最高;进化树结果显示,Fm-Lyz与不同对虾的c型溶菌酶聚为一类。实时荧光定量PCR结果显示,Fm-Lyz在所测组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)感染后,Fm-Lyz表达量比对照组明显上调(P<0.05),最高表达量时间分别为感染后24、12 h,暗示Fm-Lyz参与了墨吉明对虾的抗菌免疫防御。
大连海洋大学学报 , 2015, 30(5):478-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.05.005
摘要:ATG5(Autophagy related gene 5)基因是一种自噬相关基因,是形成自噬体的重要基因,ATG5基因的表达对自噬调控的成熟有重要作用。本研究中通过克隆,首次得到太平洋鳕Gadus macrocephalus ATG5 cDNA部分序列,该序列长为895 bp,含有完整的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码275个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子量约为32 200;经核苷酸序列比对发现,太平洋鳕ATG5核苷酸序列与半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus ATG5核苷酸序列的相似性均高达87.27%;利用太平洋鳕与其他物种ATG5核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,ATG5核苷酸序列系统进化树反映的亲缘关系基本符合传统分类学观点;氨基酸序列分析结果显示,ATG5蛋白氨基酸序列具有较高的保守性;利用绝对荧光定量PCR方法对ATG5基因在太平洋鳕各组织中的转录水平进行检测,结果显示,肝、脾和肾中的表达量高于其他组织,鳃、肾、脾、脑、肝和肌肉各组织中的ATG5 mRNA拷贝数分别为11.617 08、20.449 25、19.706 87、4.839 84、27.434 97、2.954 75 copies/ng。本研究结果将为进一步研究太平洋鳕细胞吞噬机制奠定基础,也为太平洋鳕的免疫机理和相关研究提供基础数据。
大连海洋大学学报 , 2012, 27(5):464-. doi:
摘要:通过克隆得到鲤Cyprinus carpio含钾离子通道四聚化结构域15(KCTD15)两个基因KCTD15a和KCTD15b,其开放阅读框(Open read frame, ORF)均为774 bp,编码含257个氨基酸的多肽,编码的蛋白质相对分子量均为29000, PI分别为7.0和6.5。经氨基酸比对和进化树分析表明:鲤KCTD15基因与斑马鱼Danio rerio、人Homo sapien、食蟹猴Macaca fascicularis、牛Bos taurus、小鼠Mus musculus、家鼠Rattusnorvegicus、爪蟾Xenopus laevis等的KCTD15基因具有高度同源性,均含有一个BTB (Broad-Complex,Tramtrack and Bric a brac)模块,鱼类比哺乳动物少26个氨基酸。采用半定量RT-PCR法分析了KCTD15基因在鲤组织中的表达,结果表明:KCTD15a基因只在头肾中表达且较低,在其他组织中均不表达;KCTD15b基因在卵巢中表达最高,在鳃和皮肤中次之,在脑、肝胰脏、头肾、肠等组织中表达较低。采用实时荧光定量PCR法检测KCTD15在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明:KCTD15a和KCTD15b基因都在受精后0 h表达量最高(P<0.05),在受精后6 h和12 h均迅速下降(P<0.05); KCTD15a基因在受精后36 h有所上升,但未达到6 h的水平,在受精后72 h及破膜后3 d、10 d时表达量逐渐降低;而KCTD15b基因在受精后36 h降至最低,在受精后72 h及破膜后3 d时逐渐升高,但幅度不大,破膜后10 d时再次下降; KCTD15b基因的表达量总体高于KCTD15a基因的表达量。
水产学报 , 2020, 44(3):378-. doi:10.11964/jfc.20190211672
摘要:为了解苏丹鱼MR(LhMR)的结构特点及其在抗感染免疫反应中的作用,本研究克隆并分析了LhMR基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了LhMR在正常及柱状黄杆菌感染苏丹鱼组织中的表达。结果显示,LhMR开放阅读框4 296 bp,编码1 431个氨基酸(aa)。LhMR的氨基酸序列和分子结构与其他物种高度相似,胞外1个富含蓖麻类β型三叶草的结构域(RICIN)、1个纤连蛋白Ⅱ型结构域(FNⅡ)、8个串连的C型凝集素样结构域(CLECTs)、1个跨膜区和1个胞内区。通过qRT-PCR检测显示,LhMR在脾脏、体肾、心脏、脑、皮肤、肌肉、鳃、肝脏、后肠、前肠和中肠11种组织中均有表达,其中脾脏中表达量最高;经柱状黄杆菌感染苏丹鱼后,脾脏、肠、体肾和鳃中LhMR基因的相对表达量显著升高。通过免疫组织化学(IHC)检测发现,在脾脏、肾脏和鳃中的LhMR蛋白表达水平提高。通过苏木精-伊红染色病理组织切片表明,在体肾、肠、肝脏和鳃中均有不同程度的病变。体肾的肾小管有大量的血细胞浸润,上皮细胞发生坏死;肠壁变薄,组织大量弥散坏死;肝脏组织中有多个空泡;鳃小片肿胀、混乱、坏死和脱落。研究表明,LhMR在苏丹鱼感染柱状黄杆菌免疫反应中发挥重要作用,为苏丹鱼柱形病的防控提供新的参考。
大连海洋大学学报 , 2019, 34(1):47-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2019.01.008
摘要:为探究PTEN在黄条鰤Seriola aureovittata生长发育过程中的分子作用机制,采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了黄条鰤生长调控因子PTEN的cDNA全长序列,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PTEN mRNA的时空表达特征。结果表明:黄条鰤PTEN cDNA序列全长为1575 bp,开放阅读框为1287 bp,编码428个氨基酸,PTEN编码的蛋白具有脊椎动物PTEN的共同特征,含有PTP(PTPc基序)和PTEN-C2结构域;序列比对分析发现,黄条鰤与高体鰤Seriola dumerili同源性较高,一致性达到了95%;通过系统进化树分析表明,黄条鰤与鲈形目及鲽形目鱼类聚为一支;经qPCR分析发现,黄条鰤PTEN mRNA在心脏中的相对表达量最高(P<0.05),其次在脾脏、头肾、肾脏、胃、肠、鳃中表达量较高,PTEN mRNA在多种组织中的广泛表达,暗示着其可能参与多种生理过程的调控;同时分析了PTEN mRNA在黄条鰤早期发育阶段(胚胎期、仔稚幼鱼期)中的时序表达特征,发现PTEN在早期胚胎发育中持续表达,从低囊胚时期(38 hpf)表达量显著升高(P<0.05),初孵仔鱼时期相对表达量最高(P<0.05);在仔稚幼鱼时期,PTEN mRNA 相对表达水平逐渐降低,35日龄表达量显著下降(P<0.05)并保持较低表达水平。研究表明,PTEN在胚胎及仔稚幼鱼发育过程中具有重要调节作用,本研究结果可为黄条鰤早期生长发育过程的调控机制研究及苗种培育提供数据资料。
中国水产科学 , 2017, 24(4):902-. doi:10.3724/SP.J.1118.2017.17063
摘要:牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水经济鱼类,其雌性生长速度显著快于雄性。因此,生产全雌牙鲆对提高养殖产量和经济效益具有重要意义。雌核发育是一种特殊的有性生殖方式,在这种生殖方式中,灭活的精子进入卵子,激活胚胎发育,但精核不与卵核融合形成合子,所以雌核发育的个体只具有母本的遗传信息。目前,牙鲆已成为雌核发育技术应用于产业的代表性鱼类。本文对牙鲆人工诱导雌核发育的研究进展进行综述,介绍牙鲆减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育的诱导方法,以及雌核发育技术在性别控制、克隆制备等育种研究中的应用。最后,作者提出“雌核发育育种体系”构想,并对其在鱼类育种和遗传研究中的应用前景进行展望。