水产学报 , 2019, 43(3):679-. doi:10.11964/jfc.20180511283
摘要:为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20 μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。
渔业科学进展 , 2019, 40(6):121-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20190304001
摘要:Ets蛋白是宿主MAPK信号通路下游的一类可参与调控病毒基因转录复制的重要转录因子。本研究通过基因克隆成功获得魁蚶(Scapharcabroughtonii)Ets家族9条基因(分别命名为ETS-1~ETS-9),开放阅读框(ORF)大小分别为1065、1290、1569、912、1344、1404、1521、1968和1191 bp,并分别编码354、429、522、303、447、468、506、655和396个氨基酸。系统进化树分类表明,本研究所获得的基因均属Ets家族。对ETS-1和ETS-3的氨基酸序列和三维结构分析表明,其均含有高度保守的ETS结构域。在不同水温条件下,通过人工注射牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)对魁蚶进行感染,并对病毒拷贝数和Ets的相对表达量进行定量分析。结果显示,ETS-1ETS-3只在高温阳性组中相对表达量显著上调,与病毒拷贝数在高温条件下增长趋势呈正相关;ETS-4ETS-8只在低温阳性组中相对表达量显著上调,但在高温阳性组中ETS-4ETS-8的相对表达量与病毒拷贝数呈负相关;初步研究结果显示,从魁蚶Ets基因中筛选出2条Ets基因(ETS-1ETS-3),在高温条件下(16±2)℃,其可能参与正向调控病毒OsHV-1的复制过程。本研究为进一步探索魁蚶在夏季因感染牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)而导致的大量死亡提供了科学数据。