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孔淼 , 廖梅杰 , 王印庚 , 杨振茂 , 李彬 , 荣小军 , 张正 , 于永翔 , 李欣容 , 张永刚

水产学报 , 2020, 44(9):1513-. doi:10.11964/jfc.20200312209

摘要：为了对导致辽宁大连、山东东营的2家养殖场池塘养殖刺参大量化皮死亡的新的敌害生物进行鉴定并确定其对养殖刺参的危害。本实验通过形态学观察、分子鉴定及系统发育分析确定了涡虫的分类地位，通过生态学方法确定了其生态适应条件，通过切割后培养的方法观测了其再生能力，通过与刺参苗种的共培养实验测试了该物种对刺参的危害及其危害方式。形态学观察结果显示，该涡虫体长0.96~3.26 mm，体宽0.49~1.93 mm，外观黄色或黄褐色，头部钝圆，具一对暗红色棒状眼点，尾部具两条并列的尾垂；显微镜镜检发现其表皮下分布密集的虫黄藻，体表周生纤毛，雌雄同体，口后具有两个生殖孔；对该物种 COⅠ及18S rDNA基因片段扩增测序结果进行分析，并构建基于18S rDNA基因的系统发育树，结果显示该生物与澳洲异尾涡虫序列同源性达99.64%，根据其形态学特征，并结合18S rDNA分子鉴定结果，将该生物鉴定为澳洲异尾涡虫；进一步对其生活习性进行了研究，结果显示，该生物具有避光性，其适宜温度为18~24 °C，适宜pH为5.5~8.0，适宜盐度为20~40；再生实验表明，该物种具有很强的前后轴极性再生能力；该生物与刺参的共培养实验表明，澳洲异尾涡虫对刺参体表表现出很强的趋向性，可以吸附在刺参体表导致刺参苗种溃疡、化皮甚至死亡，但刺参的体腔、肠道、呼吸树内均未发现虫体寄生。研究表明，澳洲异尾涡虫是营自由生活的池塘养殖刺参的一种新的敌害生物，在养殖过程中需要密切关注并防范该敌害生物。

关键词：刺参 , 澳洲异尾涡虫 , 敌害生物 , 形态学 , 再生 , 组织病理 , 危害

凡纳滨对虾虾苗细菌性玻化症(BVS)的病原、病理分析

王印庚 , 于永翔 , 刘潇 , 张永刚 , 张正 , 廖梅杰 , 李彬 , 蔡欣欣 , 荣小军 , 罗坤

水产学报 , 2021, 45(9):1563-. doi:10.11964/jfc.20200912396

摘要：为进一步查明对虾“玻璃苗”的主要致病原，实验通过对河北省沧州市凡纳滨对虾苗种玻化症进行了流行病学调查及病原、病理分析。结果发现，患病虾苗表现为活力降低、厌食直至空肠、空胃，虾体消瘦、暗浊；肝胰腺组织坏死性萎缩、轮廓模糊、颜色变浅呈淡黄色，甚至肝胰腺区由正常的饱满褐色组织变为无组织结构的“玻璃化”状态。组织病理观察结果显示，患病对虾肝小管上皮细胞坏死、脱落，肝小管中充斥大量的碎片组织，并逐步褐化、黑化，甚至肝小管组织大面积坏死，留有连片玻璃样均质化区域；肠道内充斥大量的组织碎片，绒毛膜脱落消失。超微组织病理观察发现，患病对虾肝小管上皮细胞的细胞膜消融，细胞器解体，细胞核固化；其后细胞解体、脱落，甚至肝小管组织结构解体消融；肝胰腺、肠道、胃黏膜周围发现大量细菌，优势菌株为杆状菌且呈弧形，未发现病毒粒子的存在。从患病虾苗分离出2株优势菌(Lv-A和Lv-B)，经人工浸染实验发现，Lv-A和Lv-B可致凡纳滨对虾PL₇苗种出现与自然患病相同的玻璃化症状，其半致死浓度分别为1.62×10³和5.38×10³ CFU/mL，致病力强。根据16S rDNA和gyrB序列分析结果发现，Lv-A和Lv-B与溶藻弧菌、新喀里多尼亚弧菌和副溶血弧菌均有较高相似性。初步将该病命名为虾苗细菌性玻化症(shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome，BVS)。药敏实验结果显示，Lv-A和Lv-B均对米诺环素、多西环素、萘啶酸等敏感，而对新霉素、吡哌酸、利福平等耐药。本研究为BVS的有效防控、保障对虾行业健康发展提供理论基础和技术支撑。

关键词：凡纳滨对虾 , 虾苗 , 细菌性玻化症 , 溶藻弧菌 , 新喀里多尼亚弧菌 , 副溶血弧菌 , 病理

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

李欣容 , 廖梅杰 , 李彬 , 荣小军 , 畅孟阳 , 王印庚 , 于永翔 , 张正 , 范瑞用 , 刘清兵

渔业科学进展 , 2022, 45(3):176-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20210424001

摘要：为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异，本研究采用人工攻毒侵染胁迫，获得刺参化皮体壁组织，并以未攻毒组的健康体壁组织为对照，对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序，解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异，筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时，通过基因组甲基化和转录组联合分析，筛选负相关关联基因，为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示，刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%，侵染组甲基化水平显著升高；在发生甲基化的位点中，攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%，mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个，注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因，筛选到差异表达基因496个，其中，上调基因214个，下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中，筛选到180个负相关关联基因，其中，差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析，筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据，也为刺参抗病性状选育提供科学参考。

关键词：刺参 , DNA甲基化 , 转录组 , 关联分析

环境、病原、免疫因子三要素与池塘养殖对虾AHPND发生的关联性

于永翔 , 王印庚 , 蔡欣欣 , 张正 , 廖梅杰 , 李彬 , 荣小军 , 朱洪洋 , 唐苗苗 , 王春元

水生生物学报 , 2023, 47(1):1-. doi:10.7541/2022.2021.0217

摘要：为研究虾急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreas Necrosis Disease, AHPND)的发生与环境、病原和虾体免疫间的相互关系, 文章对池塘养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)AHPND发生及其环境、病原、虾体免疫因子进行持续性跟踪监测。结果表明, 试验点的气温、水温、溶解氧(DO)、pH、盐度、氨氮(NH₄-N)和亚硝态氮(NO₂-N)波动范围为21—29℃、24.8—31℃、1.4—8.32 mg/L、8—8.91、34—50、0.01—0.26 mg/L和0.005—0.212 mg/L; 水体可培养细菌和弧菌数量变化范围为3×10³—2.4×10⁵和2×10²—1.8×10⁴ CFU/mL, 虾体肝胰腺内可培养细菌和弧菌数量变化范围为9.8×10⁴—8.8×10⁶和3.9×10³—3.61×10⁶ CFU/g; 16S rDNA鉴定结果显示, 在可培养优势菌株中, 弧菌检出数量达到135株, 占全部鉴定菌株的61.6%, 其中主要弧菌种类有欧文氏弧菌(Vibrio owensii)、坎贝氏弧菌(V. campbellii)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和哈维氏弧菌(V. harveyi); 虾体中ACP、AKP、SOD、LZM和PO等免疫酶活的变化范围分别为7.5—75、1—8.5、2.4—11.07、1.3—43和6.23—28 U/mg。结合AHPND发生前后各理化因子变化的相关性分析表明, 水温、虾体肝胰腺内可培养细菌和弧菌数量、DO、LZM和PO可作为池塘养殖模式下对虾警示AHPND的指示因子。相关研究结果为指导池塘养殖凡纳滨对虾健康养殖及AHPND临床防控提供数据支撑和科学依据。

关键词： AHPND , 环境因子 , 可培养细菌 , 免疫因子 , 预警因子 , 凡纳滨对虾

刺参响应灿烂弧菌侵染差异microRNAs鉴定及靶基因分析

畅孟阳 , 李彬 , 荣小军 , 王锦锦 , 于永翔 , 王印庚 , 廖梅杰 , 张正 , 范瑞用 , 刘清兵

渔业科学进展 , 2023, 44(2):107-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20211228003

摘要：microRNA参与基因的转录后调控，在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参（Apostichopus japonicus）病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一，而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌（Vibrios splendidus）为侵染菌株，通过人工侵染实验制备患病刺参样本，采用miRNA-seq技术对侵染组（PT16S）和对照组（PT10H）各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序，通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析，筛选差异表达miRNAs （DEmiRNAs）并预测其靶基因，构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。结果显示，PT10H组平均得到5 902 588条有效序列，194个已知miRNA和19个新的miRNA；PT16S组平均得到5 053 529条有效序列，182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析，共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs （P ≤ 0.05），上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因，注释到585个GO terms及24条信号通路（P ≤ 0.05），下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因，注释到514个GO terms以及22条信号通路（P ≤ 0.05）。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR （qRT-PCR）验证，显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络，结果显示，13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs，Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。

关键词：刺参 , microRNA , 灿烂弧菌 , 胁迫应答 , 靶基因 , miRNA-mRNA调控网络

刺参苗期附着基更换频率对刺参生长及其养殖系统菌群结构的影响

王印庚 , 张文泽 , 廖梅杰 , 李彬 , 荣小军 , 张正 , 李华 , 范瑞用 , 宁鲁光

中国水产科学 , 2016, 23(2):359-. doi:10.3724/SP.J.1118.2016.15193

摘要：为了探究刺参(Apoasichopus japonicus)保苗阶段(7-9月)最佳的附着基更换频率(changing frequency, CF),本实验在夏季保苗期设置5个附着基更换频率组,即CF₁₀、CF₂₀、CF₃₀、CF₄₀和CF₅₀。采用实验生态学的方法,并结合传统细菌培养法和16S rDNA细菌鉴定技术对上述不同实验组进行检测。结果表明:CF₂₀组刺参整池增重和个体增重幅度最大,CF₃₀次之, CF₅₀组由于死亡率高,整池重量为负增长。CF₂₀组的特定生长率和存活率分别为(5.986±0.135)%/d和(95.231±0.265)/%,且显著高于其他各组(P<0.05), CF₃₀次之,而CF₅₀组的特定生长率和存活率最低,且显著低于其他各组(P<0.05)。养殖用水中NH₄⁺-N、NO₂^--N和COD随着附着基更换频率的降低而升高,并在第50天时分别达到0.53 mg/L、0.28 mg/L、0.18 mg/L。各实验组水体中异养细菌和弧菌数量随附着基更换频率变化不明显,而附着基上的异养细菌和弧菌数量随附着基更换频率的降低而升高, CF₅₀组异养细菌总数在第50天时达到1.38×10⁵ cfu/cm²,弧菌数量达到1.5×10⁴ cfu/cm²,皆明显高于其他各组。附着基上优势菌为溶藻弧菌(Vibrio algindyticus)、需钠弧菌(V. natriegens)、马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)。其中,溶藻弧菌为刺参条件致病菌,且一直存在于养殖系统中并逐步占据绝对优势。这与CF₅₀组在实验进行到43 d时开始出现化皮, 50 d时开始出现死亡现象有一定的关系。同时,附着基长时间未更换,会滋生大量玻璃海鞘、日本毛壶、内刺盘管虫等敌害生物,争夺栖息空间和食物,导致刺参苗种生长减慢。综上,由实验结果显示,在7-9月高温季节每20 d更换一次附着基最佳。考虑到生产成本,附着基更换频率一般为20~30 d为宜。本研究结果为刺参苗种培育工艺的优化及刺参健康养殖提供了理论依据和参考。

关键词：刺参 , 育苗工艺 , 附着基 , 更换频率 , 生长 , 菌群结构 , 弧菌中图

养殖长茎葡萄蕨藻黑褐病的病原学研究

张艳楠 , 王印庚 , 刘福利 , 廖梅杰 , 李彬 , 张正 , 梁洲瑞 , 于永翔 , 荣小军

渔业科学进展 , 2020, 41(1):135-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20181104002

摘要：本研究从大连某养殖场发生黑褐病的长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）分离得到1株优势菌株CL2017070801002。采用该菌株浓度为10³~10⁸ CFU/ml的菌液浸泡感染长茎葡萄蕨藻，在7 d内，每个感染实验组的藻体都出现了不同程度的黑褐色典型发病症状，人工感染实验结果表明，CL2017070801002对长茎葡萄蕨藻有致病性。扫描电镜观察发现，藻体细胞壁表面聚集大量细菌，随着侵染时间加长，细胞组织破裂死亡。研究表明，CL2017070801002为本次发现的长茎葡萄蕨藻黑褐病的病原。结合革兰氏染色、生理生化特征和16S rDNA序列进化树分析结果，将该菌株鉴定为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）。药敏实验结果显示，该菌株对氯霉素、四环素、氟罗沙星、强力霉素和氟苯尼考等药物高度敏感，对庆大霉素、克拉霉素等药物中度敏感，对青霉素、头孢氨苄、头孢拉定等药物不敏感。本研究为长茎葡萄蕨藻的细菌性病害防治提供了有益参考。

关键词：长茎葡萄蕨藻 , 黑褐病 , 溶藻弧菌

盐度和溶解氧对刺参非特异性免疫酶活性的影响

郑慧 , 李彬 , 荣小军 , 廖梅杰 , 陈贵平 , 张正 , 王岚 , 王印庚 , 邹安革

渔业科学进展 , 2014, 35(1):118-. doi:

摘要：测定了不同盐度(20、25、30、35、40)和不同溶氧水平(充空气,DO 7~9 mg/L)充纯氧,DO 15~20 mg/L;不充气,DO 2~5 mg/L)对刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性变化的影响。盐度试验结果表明,盐度急性变化会引起刺参体腔液ACP、AKP、LZM活性的升高和SOD活性降低,其中第10天时盐度对酶活性的影响最大。溶氧试验显示,过饱和溶氧(DO 15~20 mg/L)可使刺参体腔液ACP、AKP、LZM、SOD活性维持在较高水平,不充气组(DO 2~5 mg/L)刺参体腔液中ACP、AKP、LZM活性出现短暂升高。恢复性试验中,盐度20、25组对AKP活性和盐度20、40组对SOD活性的影响未恢复到初始水平,其余实验组均能恢复至初始水平,说明低盐对刺参免疫力的影响较大。充纯氧组刺参的AKP活性显著高于充空气组,表明高溶解氧水平在一定程度上提高了刺参免疫力。

关键词：溶解氧 , 盐度 , 海参 , 非特异性免疫

刺参养殖池塘一株贝莱斯芽孢杆菌的分离及其生理特性

王金燕 , 李彬 , 王印庚 , 廖梅杰 , 荣小军 , 张正 , 牛盈盈 , 宁鲁光

中国水产科学 , 2018, 25(3):567-. doi:10.3724/SP.J.1118.2018.17383

摘要：2014年5月，在东营的刺参（Apostichopus japonicus）养殖池塘环境中对水样和底泥样品进行了细菌分离和益生菌的筛选，共获得66株可培养细菌。以刺参“腐皮综合征”主要致病菌为指示菌进行拮抗作用实验，使用选择培养基对菌株的产淀粉酶和蛋白酶能力进行测定，筛选获得一株潜在益生菌株——DY-6，并进行了生理生化实验、16S rDNA基因序列分析、菌株生长特性及其对刺参的安全性研究。结果表明，DY-6对其指示菌假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）、灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）均有良好的抑制作用，抑菌圈直径分别达到24 mm、22 mm、27 mm和37 mm，对淀粉和蛋白培养基的水解直径分别为28 mm和20 mm。利用该菌对刺参进行高浓度胁迫实验测试其安全性，实验期间浸浴组和投喂组刺参状态良好，没有发病和死亡现象。利用细菌生理生化和16S rDNA基因序列分析表明，DY-6与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis CP015911）的相似性为99%。因此，初步鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。同时，将该菌株与商品化微生态制剂产品中分离的4株益生菌进行了比较，DY-6在温度20~35℃、盐度0~35范围内生长较快，优于上述4株菌，4 h进入对数生长期，10 h达到生长高峰。筛选的贝莱斯芽孢杆菌具有良好的抑菌能力，生长速度快，并且具有广温广盐的优点，不仅能够降低疾病发生率，还可更好地适应黄河口地区夏季水温偏高、盐度波动大的特点，由此具有良好的益生菌商业化开发潜力。

关键词：黄河口;刺参;贝莱斯芽孢杆菌;抑菌;生理特性;安全性

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

廖梅杰 , 张正 , 荣小军 , 王印庚 , 刘智超 , 栾晶 , 李彬 , 王岚 , 陈贵平

中国水产科学 , 2014, 21(3):611-. doi:10.3724/SP.J.1118.2014.00611

摘要：根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法.构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为60℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰,扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48,相关系数为0.998,扩增效率为1,最低可检测到7个拷贝.实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义.

关键词： vhhP2基因 , 哈维氏弧菌 , 实时定量PCR , SYBR Green I