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鲫皮肤蛋白质组双向电泳与部分蛋白点的质谱鉴定

胡秀彩 , 沈晓静 , 吕爱军 , 孙敬锋 , YEONG Yiksung , 宋亚娇 , 李莉 , 孔祥会

水产学报 , 2016, 40(4):528-. doi:

摘要：为了建立鱼类皮肤蛋白质组双向电泳图谱及质谱鉴定,以鲫为实验动物,采用蛋白双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术,进行鲫皮肤的蛋白质组学研究。结果表明,当上样量为800μg,采用18 cm、pH 3~10 IPG胶条,等电聚焦80000 Vh,2-DE图谱检测为214个皮肤蛋白点,匹配率达88%;对其中31个蛋白点进行MS/MS鉴定为22种蛋白,包括肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋白、锌指蛋白585B、效应蛋白Rab15、卷曲螺旋结构域蛋白168、NCK1相关蛋白,肌酸激酶、烯醇化酶、丙酮酸脱氢酶、腺苷酸激酶同工酶等;进行蛋白功能聚类(GO)分析发现12种生物学过程,主要参与代谢、细胞、有机体、免疫应答、生物调节和信号等过程。本研究首次初步揭示鲫皮肤蛋白质组及分子机制,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。

关键词：鲫;皮肤;蛋白质组;双向电泳;质谱

斑马鱼肠道细菌的16S rDNA分子鉴定及PCR-SSCP分析

胡秀彩 , 吕爱军 , 孙敬锋 , 石洪玥 , YEONG Yiksung , 裴超 , 张超 , 李莉

大连海洋大学学报 , 2018, 33(1):39-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2018.01.007

摘要：为了解斑马鱼Danio rerio肠道细菌多样性，采用细菌分离纯化、16S rDNA基因分子鉴定技术，对斑马鱼肠道细菌进行PCR-SSCP分析。结果表明：从斑马鱼肠道分离纯化出12株细菌，分别命名为Zf1、Zf2、Zf3、Zf4、Zf5、Zf6、Zf7、Zf8、Zf9、Zf10、Zf11和Zf12，其中对7株分离菌构建pMD18-T/16S rDNA的阳性克隆测序显示，Zf1、Zf11菌株与Aeromonas veronii的16S rDNA序列一致性为99%，Zf4、Zf8菌株与Sphingomonas sp.的一致性为99%，Zf5菌株与Bacillus subtilis的一致性为99%，Zf7菌株与Aeromonas sp.M10的一致性为99%，Zf10菌株与uncultured bacterium clone GI3-M-5-G01的一致性为92%；16S rDNA分子鉴定表明，Zf1、Zf7和Zf11属于气单胞菌属Aeromonas，Zf4、Zf8属于鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas，Zf5属于芽孢杆菌属Bacillus，Zf10为一种新菌株；采用PCR-SSCP技术对12株细菌16S rDNA基因V3区进行多态性分析，结果显示，斑马鱼肠道细菌16S rDNA基因V3区存在多态性，其中Zf1与Zf11菌株带型一致，Zf4与Zf8菌株带型一致。本研究结果可为揭示鱼类肠道菌群结构对其生命活动的影响提供科学参考。

关键词：斑马鱼 , 肠道细菌 , 分离鉴定 , 16S rDNA , PCR-SSCP

半滑舌鳎创伤弧菌分离鉴定及其荧光定量PCR方法的建立

胡秀彩 , 王英杰 , 吕爱军 , 孙敬锋 , 王庆奎 , 廉正义 , 刘小雪 , 宋亚娇

水产学报 , 2019, 43(5):1359-. doi:10.11964/jfc.20181011505

摘要：为确定患病半滑舌鳎的病原，从其体内分离到3株革兰氏阴性菌，将其分别命名为ST-1、ST-3和ST-6，进行细菌理化特性、药敏试验、16S rDNA测序以及组织病理学观察等方面的研究，并建立了外膜蛋白(OMP)基因的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示，3株分离菌株的理化特性符合创伤弧菌特征，16S rDNA与创伤弧菌标准菌株ATCC29307序列相似性达99%以上，系统发育树分析显示，3株分离株与创伤弧菌自然聚为一支，最终鉴定为创伤弧菌；药敏试验显示，3株菌对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、亚胺培南和氟苯尼考等药物高度敏感。人工回归感染试验表明，分离株具有致病性，且半滑舌鳎、斑马鱼的临床症状与自然患病鱼症状相似；组织病理学观察显示，鳃丝上皮细胞增生，鳃小片肿胀黏连、颗粒细胞和黏液细胞增多，肝脏中央静脉淤血，肾脏出血、坏死，肠道黏膜固有层萎缩、黏液细胞增多等。进一步建立OMP基因的荧光定量PCR方法，结果显示，标准曲线的相关系数为0.995，检测下限为1.88×10² CFU/mL。以上结果可为半滑舌鳎弧菌病的致病机理、分子诊断和防治提供科学参考。

关键词：半滑舌鳎 , 创伤弧菌 , 组织病理 , 荧光定量PCR

鱼类皮肤免疫应答及蛋白质组学

吕爱军 , 胡秀彩 , 孙敬锋 , 石洪玥 , 陈成勋 , 李莉 , 孔祥会

水产科学 , 2016, 35(3):302-. doi:10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.020

摘要：鱼类皮肤作为黏膜免疫系统的重要组成部分，也是阻止病原微生物进入体内的第一道防线^[1]。鱼类皮肤黏膜免疫系统不仅对宿主防御病原侵入是必要的，而且对水产养殖疫苗应用也十分重要^[2-3]。

关键词：鱼类 , 皮肤 , 免疫应答 , 蛋白质组学

金鱼类志贺邻单胞菌的分离鉴定及药敏试验

张培 , 朱爱华 , 胡秀彩 , 兰云 , 李雪 , 沈晓静 , 吕爱军

水产科学 , 2015, 34(6):375-. doi:10.16378/j.cnki.1003-1111.2015.06.007

摘要：从患病金鱼肝脏中分离获得一株细菌，编号为ZP-1，通过细菌形态学观察、理化特征、16S rDNA克隆测序以及系统进化树分析等方法进行鉴定。试验结果表明，ZP-1菌株为革兰氏阴性短杆菌，可以发酵葡萄糖、乳糖产酸、还原硝酸盐、产生吲哚等。进一步采用PCR方法扩增ZP-1菌株16S rDNA，将其亚克隆至pMD18-T载体中测序，获得长度为1464 bp（登录号：KM458852），与鱼源致病性类志贺邻单胞菌（KC825322）同源性为99.80%，最终确定ZP-1菌株为类志贺邻单胞菌。采用30种抗生素进行药敏试验，ZP-1菌株对头孢噻肟、头孢克肟、头孢孟多、庆大霉素、丁胺卡那霉素、萘啶酸、氯霉素、氧氟沙星等药物敏感。

关键词：金鱼 , 类志贺邻单胞菌 , 16S rDNA , 药敏试验

鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白双向电泳与质谱鉴定

吕爱军 , 胡秀彩 , 孙敬锋 , YEONG Yiksung , 石洪玥 , 李莉 , 孔祥会

水产学报 , 2016, 40(3):379-. doi:10.11964/jfc.20151210208

摘要：为建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱并进行质谱分析,利用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术对嗜水气单胞菌的蛋白质组学进行鉴定研究。结果显示,嗜水气单胞菌28 ℃培养12 h、三氯醋酸(TCA)/丙酮沉淀法提取全菌蛋白、等电聚焦20 000 Vh的2-DE图谱匹配率达81%;采用18 cm、pH 3-10 IPG胶条进行2-DE分析获得146个蛋白点,随机选取部分蛋白点进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,共鉴定23个蛋白点包括膜脂蛋白、分子伴侣、30S核糖体蛋白S1、延伸因子、细胞色素C等,其中发现烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、精氨酸脱亚氨酶、ATP合酶α亚基、脱氧核糖核酸聚合酶亚基α、氨基甲酸激酶、腺苷酸激酶、尿苷磷酸化酶、硝基还原酶、肽酰脯氨酰异构酶共计11个代谢相关蛋白酶;基于分子功能进行蛋白分类(GO)分析,发现主要为结合(17.1%)、催化(14.3%)和转移酶(11.4%)等生物学过程。建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱与部分蛋白鉴定,有助于理解嗜水气单胞菌的蛋白质组学及其分子机制。

关键词：嗜水气单胞菌;斑马鱼;蛋白质组;双向电泳;质谱

黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及药敏试验

兰云 , 胡秀彩 , 吕爱军 , 沈晓静 , 朱爱华 , 冯照军

水生生物学报 , 2014, 38(6):1173-. doi:10.7541/2014.170

摘要：

关键词：黄喉拟水龟 , 摩氏摩根菌 , 分离鉴定 , 致病性 , 药敏试验

患病蝶尾金鱼维氏气单胞菌温和生物变种的分离鉴定

胡秀彩 , 孙金辉 , 孙敬锋 , 宋亚娇 , 吕爱军 , 陈成勋

水生态学杂志 , 2018, 39(1):105-. doi:10.15928/j.1674-3075.2018.01.016

摘要：研究从患病蝶尾金鱼（Butterfly）肝脏中分离获得的1株病菌，为金鱼疾病防治提供参考。分离纯化获得1株细菌，编号为DW-1，通过细菌形态观察、理化特性、16S rDNA序列分析等方法进行鉴定。结果表明DW-1菌株为革兰氏阴性短杆菌，可发酵葡萄糖产气，赖氨酸脱羧酶、硝酸盐还原等为阳性；进一步通过PCR方法扩增16S rDNA序列，测得长度为1 385 bp，与维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）相似性为99%~100%；构建系统发育树与维氏气单胞菌温和生物变种（A.veronii biovar sobria）模式菌株ATCC9071聚为一支。最终鉴定该菌株为维氏气单胞菌温和生物变种。人工感染试验结果表明，对斑马鱼半数致死量（LD₅₀）为1.17×10⁶CFU/mL。药敏试验结果显示该菌株对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、左氟沙星、复方新诺明等23种药物敏感。

关键词：蝶尾金鱼 , 维氏气单胞菌 , 分离鉴定 , 药敏试验

巴西龟眼炎病原菌的分离鉴定及组织病理学研究

叶明皓 , 胡秀彩 , 吕爱军 , 孙敬锋 , 刘小雪 , 宋亚娇

大连海洋大学学报 , 2018, 33(5):564-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2018.05.003

摘要：为防治龟类细菌性眼炎病，从患眼炎巴西龟Trachemys scriptaelegans（体质量约150.0 g）眼内分泌液中分离获得1株革兰氏阴性细菌，编号为G0503菌株，通过细菌形态学观察、理化特性、16S rDNA克隆和测序，以及构建系统发育进化树分析等方法，对其进行了鉴定研究。结果表明：该分离菌与甘露糖、半乳糖、肌醇等反应为阳性，与赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶等反应为阴性；进一步采用PCR方法扩增其16S rDNA序列，将其亚克隆至pMD18-T载体中测序，获得片段大小为1500 bp，与模式菌株Providencia rettgeri DSM 4542（AM040492.1）序列一致性为99.30%；构建系统发育树分析显示，该菌与Providencia rettgeri（JN644501.1）自然聚为一支，最终判定G0503菌株为雷氏普罗威登斯菌Providencia rettgeri；药敏试验结果显示，该菌株对头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异恶唑、复方新诺明等耐药；用该分离菌人工回归感染巴西龟死亡率达40%，主要呈现眼睛肿大、黏液增多，停止摄食等特征，并且与自然发病龟临床症状一致；组织病理学观察显示，病龟出现眼睑上皮细胞减少、淋巴细胞浸润等病理变化。本研究中首次报道巴西龟眼炎病原的分离鉴定，对该病防治可提供一定的参考依据。

关键词：巴西龟 , 雷氏普罗威登斯菌 , 16S rDNA , 药敏试验 , 组织病理

龟源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏特性研究

白杰 , 周美红 , 胡秀彩 , 吕爱军 , 叶明皓 , 孙敬锋

大连海洋大学学报 , 2019, 34(6):798-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2019-026

摘要：为探明患病巴西龟Trachemys scripta elegans的病原及其生物学特征，从病龟体内分离获得1株革兰氏阴性细菌，编号为TC-1，采用PCR方法扩增16S rDNA、gyrB基因序列，将其亚克隆到pMD18-T载体中测序获得片段大小分别为1503 bp、989 bp，与GenBank中模式菌株弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii序列相似性分别为99.60%、98.80%；系统进化树分析显示，分离菌株与C.freundii自然聚为一支，最终鉴定分离菌株TC-1为弗氏柠檬酸杆菌；药敏试验显示，TC-1菌株对头孢哌酮、头孢他啶、萘啶酸、诺氟沙星、左氟沙星、四环素、氟苯尼考和亚胺培南等药物敏感，对阿莫西林、头孢氨苄、磺胺异恶唑和复方新诺明等耐药；人工回归感染试验显示，TC-1菌株对巴西龟有致病性，并与自然发病龟的临床症状基本一致。本研究结果可为龟类弗氏柠檬酸杆菌的分子诊断及防治提供参考依据。

关键词：巴西龟 , 弗氏柠檬酸杆菌 , 16S rDNA , gyrB基因 , 药敏试验