河北渔业 , 2017, 0(4):34-. doi:10.3969/j.issn.1004-6755.2017.04.011
摘要:2012年5月对太子河流域着生藻群落结构和水环境理化特征进行了野外调查。基于香农威纳指数、均匀度指数、丰富度指数及典范对应分析等方法,分析了着生藻群落结构特征。共鉴定出着生藻101种;物种密度平均值为9.10×106 cells/L;香农威纳指数平均值为2.92;丰富度指数平均值为2.90。典范对应分析得出,太子河流域着生藻群落结构的驱动因子是电导率、水深、河宽和总氮。综合分析得出结论,太子河流域着生藻多样性相对较高,水体处于中度污染状态。
水产学报 , 2019, 43(3):679-. doi:10.11964/jfc.20180511283
摘要:为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20 μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。
大连海洋大学学报 , 2018, 33(1):77-. doi:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2018.01.013
摘要:为评价浑太河流域影响大型底栖动物群落结构的环境因子在不同水生态功能区间的差异性,于2012年春季对浑太河65个采样点进行大型底栖动物和水体理化环境因子的取样调查。结果表明:浑太河流域3个水生态功能区大型底栖动物的物种组成比例、指示种有显著性差异(P<0.05),大型底栖动物的Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数和物种丰富度有显著性差异(P<0.05),且不同水生态功能区环境因子也存在显著性差异(P<0.05);典范对应分析显示,水生态功能Ⅰ区的驱动因子是海拔、水深、总氮,水生态功能Ⅱ区的驱动因子是高锰酸钾盐指数、盐度,水生态功能Ⅲ区的驱动因子是溶解氧、电导率、盐度;相关性分析显示,水生态功能Ⅰ区海拔、总氮与Shannon-Wiener多样性指数显著相关,高锰酸钾盐指数与Pielou均匀度指数显著相关(P<0.05),溶解氧、海拔、总氮与物种丰富度显著相关(P<0.05);水生态功能Ⅱ区环境因子与Shannon-Wiener多样性指数相关性不明显(P>0.05),海拔、电导率、盐度、总溶解固体与Pielou均匀度指数显著相关,海拔与物种丰富度相关(P<0.05);水生态功能Ⅲ区环境因子与这些指数相关性不明显(P>0.05)。研究表明,浑太河流域不同水生态功能区大型底栖动物群落结构组成具有空间异质性,环境因子有显著性差异,不同水生态功能区影响大型底栖动物群落结构的环境因子存在差异性。
水产学报 , 2015, 39(11):1721-. doi:10.11964/jfc.20150209720
摘要:为了明确引起坛紫菜绿斑病的病原,对2012年发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿斑病开展了病原的分离鉴定和致病性研究。利用2216E海水培养基平板,从患病藻体分离得到一株优势细菌X5;在实验室条件下将X5进行回接感染实验,在显微镜下观察到坛紫菜叶状体发生组织病理变化,出现绿斑病症状:感染初期出现黄绿色小斑点,病斑逐渐扩大出现空洞,最后导致紫菜叶片流失;用浓度为104~108 cfu/mL的X5感染坛紫菜时,在7 d内引起紫菜出现10%~100%病斑面积,这些结果表明X5为坛紫菜绿斑病的病原。利用生理生化和多基因序列分析方法对X5进行鉴定,结果显示该菌为革兰氏阴性菌,大小为0.6 μm×0.4 μm~1.0 μm×0.4 μm,无鞭毛,在温度4~42℃、盐度50~150、pH6~10范围内生长,最适生长温度为16℃,最适生长盐度为50,最适pH为7,对甲硝唑、林可霉素和青霉素耐药,对25种抗生素敏感,Biolog和API ID-32E细菌鉴定系统的结果显示X5为弧菌属细菌(Vibriosp.);基于多基因序列(16S rRNA,rpoA,recA,pyrH)构建的系统进化树分析显示,X5与V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis聚为一支,进化距离为0.095~0.108,这些结果说明X5为弧菌属的一个新种或是V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis之一的一个新亚种。本研究报道了弧菌X5能够引起坛紫菜绿斑病,为紫菜流行病学及疾病防治提供了理论支撑。
渔业科学进展 , 2017, 38(4):25-. doi:10.11758/yykxjz.20160325003
摘要:本研究以引起珍珠龙胆石斑鱼[Epinephelus fuscoguttatus (♀)×Epinephelus lanceolatus (♂)]幼鱼"皮肤溃疡病"的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ML01株为研究对象,采用平板膜覆盖技术和柱层析技术,分离、纯化了ML01株的胞外产物及分泌性蛋白。应用毒性试验、质谱分析与分子克隆技术,对纯化的胞外产物和3种主要的分泌性蛋白进行了特性分析与鉴定。结果显示,哈维氏弧菌ML01株的胞外产物(Extracellular products,ECPs)具有酯酶、明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶活性,无脲酶活性。ECPs对羊红细胞无溶血性,对斑马鱼(Danio rerio)的半数致死剂量(LD50)为19.55μg/g鱼体重。从ML01株中分离到3种主要的分泌蛋白P42、P36、P31,其分子量分别为42、36、31 kDa。经质谱鉴定和分析,这3种蛋白分别为哈维氏弧菌的外膜蛋白OmpU和OmpN,以及一种功能未知的蛋白。利用同源克隆,成功地从ML01株基因组中扩增到了P42、P36、P31的基因。序列测定和比对结果显示,ML01株的这3个基因与哈维氏弧菌ATCC 33843(GenBank CP009467)的相应基因相比,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列的相似性分别为97.08%、100%、99.67%,其编码的多肽序列的相似性分别为99.71%、100%和99.93%。本研究对进一步分析哈维氏弧菌ML01株的致病机理、研发该菌的亚单位疫苗具有重要的参考价值。
水产学报 , 2018, 42(2):216-. doi:10.11964/jfc.20161210667
摘要:为获取2001年低温冻存栉孔扇贝感染牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)变异株(ZK2001)基因组序列,并分析ZK2001与其他OsHV-1变异株的序列差异和系统发育关系,利用基于长片段PCR的基因组DNA的扩增和富集技术,获取2001年栉孔扇贝感染OsHV-1变异株的基因组DNA;再使用Illumina Hiseq 2500 PE250高通量测序平台对其测序。最后分析ZK2001与OsHV-1其他变异株基因组的序列差异和系统发育关系。测序数据组装后获得8个Scaffold。基因组变异分析结果显示,ZK2001与参考基因组相比存在328个SNP位点,SNP和序列插入/缺失变异是导致OsHV-1基因组序列变异的主要变异类型。系统发育分析结果显示,ZK2001变异株与分离自我国的OsHV-1变异株亲缘关系最近,与分离自欧洲的OsHV-1μvar及其相关变异株的亲缘关系最远,说明中国和欧洲分布OsHV-1间存在因地理隔离导致的遗传分化。研究表明,基于长片段PCR的DNA富集技术,可以有效地扩增和富集冷冻样本中OsHV-1基因组DNA,并应用于高通量测序。OsHV-1不同变异株基因组序列数据的获取和积累,将为其基因组尺度的基因变异、株系演化和系统发育关系等研究提供重要基础。
水产学报 , 2014, 28(2):274-. doi:10.3724/SP.J.1231.2014.48942
摘要:在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到E.coil BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。
水产学报 , 2014, (7):999-. doi:10.3724/SP.J.1231.2014.49153
摘要:为评价皂角苷增强鱼类非特异免疫效果,分别用浓度为0、15和35 mg/L的皂角苷浸泡大菱鲆,分析了浸泡后6、12、24、48和72 h时大菱鲆白细胞的吞噬活力、血清补体旁路途径溶血活性、血清与黏液中溶菌酶活性、抑菌活性与碱性磷酸酶(AKP)活性及血清总蛋白浓度。结果显示,皂角苷低浓度组(15 mg/L)与高浓度组(35 mg/L)大菱鲆白细胞吞噬活力分别在浸泡后12与24 h出现显著的增高(P<0.05)。实验组大菱鲆血清中补体旁路途径溶血活性除低浓度组在12与24 h较对照组低外,其他检测时段均高于对照组(P<0.05)。血清溶菌酶活性最高值出现在低浓度组浸泡后6 h时,黏液中未能检测出。不同时间点各组大菱鲆黏液抑菌活力变化幅度较大,两实验组黏液抑菌活力在浸泡后6与12 h时较对照组提高,两个实验组间无差异(P>0.05)。血清中AKP活力高峰值出现在浸泡后6与12 h,该时段AKP的活力显著高于对照组,且实验组间存在差异(P<0.05),而黏液中AKP高峰值出现在12 h,该时段AKP的活力显著高于对照组(P<0.05),实验组间无差异。浸泡皂角苷后6 h高浓度组血清中蛋白浓度达到最高值,除12 h时各组差异不显著外(P>0.05),24~72 h高浓度组中血清蛋白含量均高于低浓度及对照组(P<0.05)。研究表明,皂角苷具有提高鱼类非特异免疫水平的效果。
渔业科学进展 , 2020, 41(2):183-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20190709001
摘要:本研究对编码牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)囊膜蛋白的orf111基因进行了生物信息学分析、克隆和表达。首先,通过特异性PCR扩增得到orf111基因全长序列,并对其编码囊膜蛋白的理化性质、高级结构、跨膜区和抗原决定簇等进行生物信息学分析。结果显示,orf111编码一种稳定的疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域和9个抗原决定簇,同时,氨基酸序列中还包含1个高度保守的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)结构域。随后,构建了pET28a-orf111重组质粒,并将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。最后,通过使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,表达产物分子量约为32 kDa。本研究应用原核表达得到了含RGD结构域的OsHV-1囊膜蛋白,为进一步制备ORF111蛋白单克隆抗体及开展牡蛎疱疹病毒侵染机制的研究奠定了重要基础,为将来OsHV-1的防控工作提供新的思路。
渔业科学进展 , 2019, 40(3):103-. doi:10.19663/j.issn2095-9869.20180417002
摘要:褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10 d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,病鱼外观无明显异常,但反应迟钝,伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现,各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 µm的肿大细胞。超薄组织切片中发现,肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150 nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物,从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus,RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因1362 bp的全长编码区,构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树,结果显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征,揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主,为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。