摘要：本研究旨在应用实时荧光定量PCR 技术, 建立半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)线粒体DNA(mtDNA)含量测定方法并进行优化。通过质粒标准品的线性化处理、模板DNA 的酶切和超声处理、mtDNA 和核DNA(nDNA)基因引物的筛选实验, 建立半滑舌鳎mtDNA 含量测定方法。结果表明, 质粒标准品的构象对荧光定量PCR 标准曲线影响较大, 线性化的质粒更适合用作标准品;酚-氯仿方法提取的模板DNA 适用于mtDNA 含量测定, 无需进行预处理;用D-loop 和ND1 这2 对引物所得的拷贝数较小且结果一致, 适用于mtDNA 拷贝数的测定;以不同核基因为参照所得的mtDNA 含量可能存在差异, 当以单拷贝核基因ENC1 和MYH6 为参照时, 可以计算出单个细胞中mtDNA 含量, 若以多拷贝基因GAPDH 为参照, mtDNA 含量测定值则较小。采用本方法分别对半滑舌鳎肝、肾、脾和肌肉组织的mtDNA 含量进行重复性检测实验, 结果表明, 相同组织的mtDNA 含量显示出良好的重复性(P>0.05),而不同组织中mtDNA 含量具有差异性, 可见该方法稳定可靠, 能为海洋鱼类mtDNA 含量检测提供借鉴。

摘要：转录因子Runx2和Osterix在高等脊椎动物骨骼发育的调控过程中具有重要作用。本研究以Runx2和Osterix基因作为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术分析了两个转录因子在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的表达水平变化。研究结果显示,Runx2和Osterix在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有较广泛的分布,并在脾组织中表达量最高,在背鳍、脑等组织中次之,在肝、肠、胃等组织中仅有微弱的表达。在半滑舌鳎早期发育阶段(卵期、仔鱼、稚鱼和幼鱼),Runx2和Osterix的时序性表达特征如下:1) 孵化前,Runx2在卵裂期与原肠期的表达水平最高,在胚胎期最低,而Osterix表达水平呈逐渐升高的趋势并在胚胎期达到最大值,表明两个基因功能作用的起始可能存在一定的时序性;2) Runx2和Osterix在1-5日龄仔鱼阶段的表达水平均呈现先升高后降低的趋势,而在10-90日龄稚、幼鱼阶段未呈现特定的变动规律,表达量在一定范围内呈波动变化;3) 相关性分析结果显示,两个基因的表达量在孵化后(1-90日龄)存在显著的相关性。研究结果表明,Runx2和Osterix基因可能共同参与半滑舌鳎早期发育阶段生长发育调控,但其与骨骼发生、发育的相关性有待进一步研究。

摘要：Dorsalin-1 是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)家族成员, 在调控脊椎动物神经系统的发育中具有重要作用。目前, 国内外有关脊椎动物Dorsalin-1 的研究报道十分有限。本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Dorsalin-1-like 基因的cDNA 序列, 并分析了Dorsalin-1-like mRNA 在半滑舌鳎成鱼的组织表达差异及其在早期发育阶段的表达水平变化。研究结果表明, 半滑舌鳎Dorsalin-1-like 基因cDNA全长为1 961 bp,包括了153 bp 的5′非翻译区(5′UTR)、编码419 个氨基酸的1 260 bp 的开放读码框(ORF), 以及548 bp 的3′非翻译区(3′UTR)。同源性分析和分子进化聚类分析结果显示, 半滑舌鳎 Dorsalin-1-like 与红鳍东方鲀(Taleifugu rubripes)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等的同源性最高, 并与之共同聚为鱼类Dorsalin-1 分支。此外, Dorsalin-1-like mRNA 在半滑舌鳎成鱼的13 个组织中具有广泛的分布, 并在心脏组织中表达量最高, 在肝、脊髓等组织中次之。在半滑舌鳎早期发育阶段(卵期、仔鱼、稚鱼、幼鱼)中, Dorsalin-1-like 在卵期中的胚胎期表达量最高, 其次为前期仔鱼期。上述实验结果表明, Dorsalin-1 在调控卵期和仔鱼期的早期发育中具有重要作用, 并可能通过调节神经系统的发育进而参与心脏、骨骼等组织的发育调控。本研究旨在揭示Dorsalin-1-like 基因在调控半滑舌鳎早期神经系统发育的重要作用, 并为筛选半滑舌鳎骨骼发育的调控因子奠定理论基础。

摘要：本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的cDNA序列,并分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势。结果表明,半滑舌鳎BMP4基因cDNA全长为1680 bp,包括了419 bp的5'非翻译区(5'UTR)、编码403个氨基酸的1212 bp的开放阅读框(ORF)以及49 bp的3'非翻译区(3'UTR)。同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,半滑舌鳎与已报道慈鲷科(Cichlidae)各鱼种的同源性最高,并与之共同聚为鱼类BMP4分支。BMP4 mRNA在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有广泛的分布,并在鳃组织中表达量最高,其次在背鳍、软骨等组织具有中等水平的表达。此外, BMP4基因在早期胚胎发育阶段(卵裂期和原肠期)具有极高水平的表达,此后其表达水平逐渐降低;但在后期仔鱼期(孵化后3日龄和4日龄),其表达水平再次升高。整体原位杂交检测结果表明, BMP4 mRNA在早期仔鱼期主要在头部及躯干前部表达;后期仔鱼BMP4基因主要在冠状幼鳍、上下颌及胸鳍处表达;进入稚鱼期后在鳃盖骨及各鳍均有表达。上述研究结果揭示了BMP4在半滑舌鳎早期骨骼发育中的重要作用,为揭示海水硬骨鱼类骨骼发生、发育的调控机制奠定了理论基础。