渔业研究 , 2019, 41(2):96-. doi:10.14012/j.cnki.fjsc.2019.02.002
摘要:根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV)RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV。系统进化树分析结果表明XMNNV与RGNNV聚类在一起,与SJNNV、BFNNV和TPNNV等其他鱼类神经坏死病毒亲缘关系较远,说明本研究分离得到的XMNNV属于RGNNV基因型。通过超速离心方法对病毒进行提纯,得到了纯化的NNV病毒。电镜观察结果表明,病毒粒子直径20~25 nm,结构为正二十面体,与已经报道的NNV结构一致。通过对XMNNV与其它RGNNV RNA2基因进行序列比对,在保守区设计引物,运用RT-PCR方法建立了RGNNV的PCR检测方法,该方法灵敏度高达67 copies/μL。纯化的病毒对E11(条纹月鳢细胞系)和大黄鱼肌肉细胞进行感染,结果表明该病毒可以感染这两种鱼类细胞。E11细胞被感染病毒后,细胞出现空泡化,并最终导致细胞分解死亡;大黄鱼肌肉细胞感染后,细胞变圆,慢慢从培养皿壁脱落,最终解体死亡。另外,对感染后细胞进行PCR检测,结果显示为阳性,进一步确定了分离的NNV具有感染这两种细胞的能力。本研究通过电镜观察和PCR检测两种方法确定了患病石斑鱼携带NNV,通过对两种鱼类细胞的感染实验,确定了该病毒具有一定的感染能力。综上,本研究为石斑鱼NNV疾病的诊断提供了有效的方法,对石斑鱼NNV疾病的预防具有一定的指导意义。
水产学报 , 2014, (9):1243-. doi:10.3724/SP.J.1231.2014.49265
摘要:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系经LPS处理后6 h LcALP表达量降低,12 h显著下调,而poly I:C处理后表达水平持续上升,24 h显著上调至峰值。研究表明,LcALP在大黄鱼胚胎发育调控以及机体免疫防御中发挥重要作用。
水产学报 , 2014, (4):492-. doi:10.3724/SP.J.1231.2014.49122
摘要:酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ(14-3-3ζ蛋白)是14-3-3蛋白家族的亚型之一。14-3-3蛋白是一种高度保守的酸性可溶性蛋白,它可以与激酶、磷酸酶等多种信号蛋白结合,并在信号转导和细胞凋亡等过程中发挥相应的作用。本实验通过SMART-RACE技术首次获得了杂色鲍14-3-3ζ基因的全长,并命名为Hd14-3-3ζ,其cDNA 全长为3 010 bp,ORF为819 bp,共编码272 个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,Hd14-3-3ζ基因在杂色鲍各组织中均有表达,其中在肝胰腺和血细胞中的表达量相对较高。当处于缺氧环境下时,鳃组织中Hd14-3-3ζ的表达在4 h时存在显著差异,血细胞中Hd14-3-3ζ在24 h和96 h时表达量显著上调。高温应激下,Hd14-3-3ζ在血细胞中的表达量无显著变化,而鳃组织中Hd14-3-3ζ在96 h的表达量却显著上调。高温缺氧联合应激实验表明,鳃组织中Hd14-3-3ζ在4 h、24 h和96 h均显著上调,而血细胞中的表达量没有显著性变化。经检测发现,副溶血弧菌注射后,鳃组织中Hd14-3-3ζ在3 h和24 h,血细胞中在6 h和24 h的表达量显著上调。以上温度、溶氧量等环境因素以及病原菌的刺激均会导致Hd14-3-3ζ在不同组织中表达量的显著变化,说明Hd14-3-3ζ在杂色鲍的免疫反应中可能扮演着重要的角色。
中国水产科学 , 2019, 26(2):314-. doi:10.3724/SP.J.1118.2019.18173
摘要:在水温(21±1)℃下,给体重(592.5±52.5)g的日本鳗鲡(Anguilla japonica)雌亲鱼投喂每千克体重含0.034 g淫羊藿和0.034 g菟丝子浸膏的饲料90 d,对照组投喂人工配合饲料,研究淫羊藿和菟丝子对卵巢发育的影响。结果显示,饲料中添加淫羊藿和菟丝子的雌鱼卵巢大部分卵母细胞属第Ⅱ时相,性腺指数和肝体比均显著高于对照组(P<0.05);卵母细胞油滴明显增多,部分卵母细胞胞质已充满油滴,核仁变小增多;血清雌二醇(E2)和11-酮基睾酮(11-KT)水平显著升高(P<0.05),实验组11-KT含量约为对照组的4倍;肝脏卵黄蛋白原基因vtg表达量升高,实验组和对照组卵巢cyp19a1仅微量表达,肝脏未检测到erαerβ的表达;实验组肌肉总脂肪酸、饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和高度不饱和脂肪酸(HUFA)含量均显著高于对照组(P<0.05),最主要的高度不饱和脂肪酸花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量均显著高于对照组(P<0.05)。本研究表明,在亲鱼培育饲料中添加中草药淫羊藿和菟丝子促进了日本鳗鲡卵母细胞油滴和肝脏卵黄蛋白原增加,提高了肌肉高不饱和脂肪酸的积累,为卵黄生成和卵母细胞进一步发育做好更充分的准备。
水产学报 , 2015, 39(3):305-. doi:10.11964/jfc.20140909481
摘要:髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLR(toll-like receptor)信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡MyD88基因cDNA全长序列,命名为AaMyD88,其全长为1 539 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的MyD88十分相似,具有MyD88家族典型的死亡结构域和TIR(toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR 结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示,欧洲鳗鲡MyD88氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为76.3%,与其他鱼类相似性为67.5%~73.2%,与哺乳动物相似性较低,为61.6%~62.6%。欧洲鳗鲡MyD88在系统进化树中与其他鱼类MyD88聚为一支,哺乳类以及两栖类MyD88分别聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,AaMyD88基因在欧洲鳗鲡各组织器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏、肠、脾脏以及肾脏中也有较高的表达,而肌肉和鳃中的表达水平较低;欧洲鳗鲡经山羊IgG肌肉注射后,肾脏AaMyD88基因在第7天表达量有显著性提高,14 d后恢复至正常水平,而脾脏AaMyD88基因表达水平从第7~21天持续显著上调,于第7天达到峰值,其表达量为肾脏的1.7倍;欧洲鳗鲡鳍细胞系经poly I:C处理后,AaMyD88基因表达水平在3 h显著降低,6~48 h均有显著升高,于12 h达到峰值。LPS处理后的欧洲鳗鲡鳍细胞系AaMyD88基因表达水平在3 h显著降低,6和12 h显著升高,于12 h达到峰值,24 h后恢复至正常水平。poly I:C处理组MyD88基因表达水平在12~48 h均显著高于LPS处理组。研究表明,MyD88在欧洲鳗鲡抵御外源微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。
水产学报 , 2015, 39(9):1273-. doi:10.11964/jfc.20150309785
摘要:在鱼类的早期胚胎发育中生殖细胞便与体细胞分离,形成所谓的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)。母源性基因Dead end(dnd)在胚胎发育中特异地表达于原始生殖细胞,编码一种进化上保守的RNA结合蛋白,对生殖细胞发育具有重要作用。本研究通过PCR获得大黄鱼dnd基因(Lcdnd)的部分cDNA序列,结合实时定量PCR、整胚原位杂交等技术,研究Lcdnd在各组织和胚胎发育中的表达。实时定量PCR结果显示:dnd在性腺中特异表达,且其在卵巢中的表达量高于精巢; 检测的各期胚胎中都有dnd的表达,随着胚胎发育其表达量呈下降趋势。整胚原位杂交结果显示:Lcdnd在早期卵裂阶段主要分布于分裂沟,到囊胚期至原肠早期则开始定位于细胞内,原肠早期时定位在胚环中的中内胚层,且阳性信号增多,暗示此时原始生殖细胞的形成。接着原始生殖细胞沿胚环向胚体形成处(胚盾)迁移; 随着胚胎的发育,发现胚体两侧的阳性信号增多; 到体节发生期,阳性信号细胞分布于胚体两侧的侧板中胚层,随着体节的发生这些细胞沿背腹轴向腹部运动; 发育到孵出期时,到达了发育中的原始生殖嵴。本研究首次使用dnd作为较为可靠的大黄鱼生殖细胞标记,揭示了大黄鱼原始生殖细胞的起源与迁移,为大黄鱼生殖细胞发生发育及养殖大黄鱼的育性控制研究奠定一定的基础。
中国水产科学 , 2013, 20(5):939-. doi:10.3724/SP.J.1118.2013.00939
摘要:利用本实验室获得的杂色鲍(Haliotis diversicolor)转录组测序数据库, 筛选出杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶(Purple acid phosphatase, PAP)同源片段, 进而克隆获得PAP 的cDNA 全序列, 命名为HdPAP, 并进行了HdPAP 蛋白的结构分析和功能预测, 同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析HdPAP 基因的组织表达谱和应激条件下的HdPAP 表达变化。HdPAP 基因cDNA 全长1 215 bp, 含有1 个编码322 个氨基酸的969 bp 的开放阅读框。经Blast比对, 与无脊椎动物半索动物门囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的PAP 氨基酸序列一致性最高, 达59%。通过实时定量PCR 检测, HdPAP 在检测的杂色鲍各组织中均有表达, 其中在血细胞和肝胰腺的表达量显著高于其他各组织(P<0.05)。高温应激下, 在检测的6 个时相中, HdPAP 在血细胞、肝胰腺和鳃中均出现不同程度的表达抑制。缺氧应激后, 4 h 血细胞中HdPAP 显著低于对照组, 24 h 恢复到正常水平, 96 h 显著高于对照组(P<0.05), 到192 h 又恢复到正常水平。副溶血弧菌感染实验中检测到HdPAP 在血细胞中同样出现表达抑制现象, 3 h 和6 h 均检测到感染组HdPAP 表达量显著低于对照组(P<0.05)。PAP 在高温、缺氧及弧菌感染下显著的表达抑制从转录水平揭示了其作为表达下调的酯酶可能参与胁迫下的生物代谢和免疫反应。
中国水产科学 , 2018, 25(6):1172-. doi:10.3724/SP.J.1118.2018.17439
摘要:从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段,利用5'RACE和3'RACE技术首次克隆获得其cDNA,全长为1602 bp,包含1356 bp的开放阅读框,编码451个氨基酸,预测蛋白质分子量为49.78 kD。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白,氨基酸序列的第142~148位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG)。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotesoct ocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%~95%,且在系统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史阶段的表达进行检测,结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P<0.05)。我们进一步构建了α-微管蛋白重组表达载体,并转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta (DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白分子量约为50 kD,与预测的结果一致,即成功诱导表达α-微管蛋白。本实验结果为后续制备α-微管蛋白有效亚单位疫苗防治刺激隐核虫病奠定了基础。
水产学报 , 2013, 37(6):830-. doi:10.3724/SP.J.1231.2013.38463
摘要:同种移植炎症因子AIF-1(allograft inflammatory factor 1,AIF-1)是一种由干扰素γ诱导的含有EF-hand结构域的钙离子结合蛋白,其功能主要是参与移植排斥、免疫炎症反应、自身炎性和非炎性的损伤等。首次克隆了杂色鲍AIF-1基因cDNA全序列,命名为HdAIF-1,其全长为942 bp,开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸。实时荧光定量PCR结果表明: HdAIF-1在杂色鲍各组织中均有表达,其中在血淋巴和鳃中表达量最高。高温应激下,HdAIF-1在鳃组织中各时相表达均显著上调,并在温度升至31 ℃时达到最高。而血淋巴和肝胰腺中HdAIF-1在高温应激前4个时相表达无显著差异,到了96 h均显著上调。缺氧应激下,HdAIF-1在血淋巴中表达变化没有显著差异,而鳃中24 h显著下调,192 h显著上调。副溶血弧菌感染实验表明HdAIF-1基因在感染后3、24 和48 h均检测到HdAIF-1的表达量显著上调。高温和缺氧应激以及弧菌感染均显示HdAIF-1基因表达量发生显著变化,说明HdAIF-1可能作为免疫因子在杂色鲍应激等状况下发挥重要作用。
上海海洋大学学报 , 2013, 22(4):496-. doi:
摘要:利用SMART RACE技术克隆得到拟穴青蟹ERK信号通路的酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ(14-3-3ζ蛋白)基因。其cDNA全长1 092 bp,编码248个氨基酸。实时定量PCR结果显示14-3-3ζ基因在各组织器官均有表达,但在卵巢中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在卵黄发生中期14-3-3ζ的表达量显著高于增殖期(P<0.05),推测其在青蟹卵巢中发挥重要作用。