首页 >  水生生物学报 >  扬子鳄FoxO1基因CDS序列的克隆及其在初孵鳄性腺组织的时空表达规律

2022, 46(8): 1142-1149. doi: 10.7541/2022.2021.122

扬子鳄FoxO1基因CDS序列的克隆及其在初孵鳄性腺组织的时空表达规律

1. 安徽师范大学生命科学学院, 芜湖 241000

2. 安徽省扬子鳄繁殖研究中心, 宣州 242000

3. 安徽师范大学, 安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室, 芜湖 241000

通讯作者: 聂海涛, niehaitao@ahnu.edu.cn 通讯作者: 吴孝兵, wuxb@mail.ahnu.edu.cn

收稿日期:2021-06-23
修回日期:2022-01-23

基金项目:   安徽省自然科学基金青年项目(2008085QC108); 安徽高校自然科学研究重点项目(KJ2019A0485); 安徽省重大科技专项(202003a06020028); 安徽师范大学大学生创新创业训练计划项目(201910370171和202010370201)资助 

关键词: 性腺复合体 , 卵子发生 , FoxO1 , 组织表达 , 时空表达 , 扬子鳄

THE CLONE OF FOXO1 GENE AND ITS SPATIOTEMPORAL EXPRESSION IN GONADAL COMPLEX OF NEWLY HATCHED ALLIGATOR SINENSIS

1. College of Life Sciences Anhui Normal University, Wuhu 241000, China

2. Anhui Breeding and Research Center of Chinese Alligator, Xuanzhou 242000, China

3. Anhui Protecting and Utilizing Key Laboratory of Important Biological Resources, Wuhu 241000, China

Corresponding author: Hai-Tao NIE, niehaitao@ahnu.edu.cn Corresponding author: Xiao-Bing WU, wuxb@mail.ahnu.edu.cn

Received Date:2021-06-23
Accepted Date:2022-01-23

Keywords: Gonadal complex , Oogenesis , FoxO1 , Tissue expression profile , Spatio-temporal expression , Alligator sinensis

研究以初孵扬子鳄(Alligator sinensis)性腺组织为实验材料, 开展Forkhead box家族蛋白-1(FoxO1)基因CDS区克隆和序列特征分析。利用免疫组织化学检测其在胃、肠和肺脏等组织中的表达谱, 结合免疫荧光(IF)、RT-PCR和Western Blot探讨其在不同出壳后日龄(17日龄、63日龄和96日龄)雌性扬子鳄性腺组织中的时空表达规律, 探讨其在雌性扬子鳄性腺发育过程中的生物学功能。研究成功克隆获得FoxO1基因长度为1941 bp的完整编码区及646个预测编码氨基酸序列。与其他物种间进行同源性比对和构建进化树分析发现, 扬子鳄FoxO1基因与鸟类的亲缘关系相较中华鳖(Pelodiscus sinensis)和原矛头蝮(Protobothrops mucrosquamatus)等爬行动物更近。在其他脊椎动物中, 哺乳动物、硬骨鱼和两栖物种也各自聚类称为子群, 表明FoxO1兼具功能保守性和种间特异性; 免疫组织化学结果表明FoxO1在初孵鳄性腺复合体、肺、胃和肠中均有表达, 免疫荧光结果表明17日龄性腺组织中的FoxO1主要表达于肾上腺和中肾区但在皮质部呈微弱表达, 在63日龄性腺皮质部表达逐渐上调且呈无规则随机分布, 在96日龄性腺皮质部中卵母细胞发育程度更高的位置呈强表达; RT-PCR结果表明不同时期扬子鳄性腺组织FoxO1基因mRNA表达量差异不显著, Western Blot结果显示性腺组织中的FoxO1表达量呈先上升后下降的变化模式, 表现为63日龄FoxO1基因表达量显著高于17日龄和96日龄, 相关结果对于丰富扬子鳄卵子发生调控机制提供了重要的研究参考。

The molecular cloning and sequence characteristic analysis of Forkhead Box protein-1 (FoxO1) CDS region were investigated using the gonad tissues of Alligator sinensis in the resent research. Immunohistochemistry was used to detect its expression patterns in in peripheral tissues such as stomach, intestine, and lung. Immunofluorescence (IF), RT-PCR and Western blot were used to investigate the temporal and spatial expression patterns in the gonadal tissues of Chinese Alligator at different days of age (17, 63 and 96 days of age), and to investigate the biological functions in the gonadal development of Chinese alligator. The complete coding region of FoxO1 gene and predicted coding amino acid were 1941 bp and 646 aa, respectively. Homology comparison and phylogenetic tree analysis showed that FoxO1 of Chinese alligator was more closely to birds than reptiles such as Pelodiscus sinesis and Protobothrips mucrisquamatus. Other vertebrates such as mammals, teleost, and amphibians were also grouped into subgroups, suggesting that FoxO1 is both functionally conserved and species-specific. FoxO1 protein expressed in the newly hatched crocodile gonadal complex, lung, stomach and intestine. FoxO1 expressed significantly higher in the ovarian tissue at the 17th days post-hatched than that at the 63rd and 96th days post-hatched individuals. FoxO1 mainly expressed in the adrenal and mesonephrons but weakly expressed in the cortex of ovarian collected at the 17th days post-hatched, and its irregular and randomly distribution was gradually upregulated in the cortex at the 63rd days post-hatched individual. FoxO1strongly expressed in the cortex of the 96th days post-hatched individual ovarian tissues where oocytes were more developed. FoxO1 mRNA level was no significant difference in the gonadal tissues of Chinese alligator at different periods. These results provide important reference for enriching the regulation mechanism of oogenesis of Chinese Alligator.

扬子鳄(Alligator sinensis)在脊椎动物分类上隶属于爬行纲鳄目(Crocodylia), 主要分布在长江中下游地区。其作为中国特有的爬行动物, 由于自然栖息地持续丧失、斑块化及人类的肆意猎杀造成了近代以来野生扬子鳄数量持续下降, 导致现存野生数量非常稀少。1973年联合国将其列为临危种和禁运种我国已经把扬子鳄列为国家一类保护动物, 严禁捕杀[1]。为防止扬子鳄灭绝, 目前采用人工繁殖的方式进行保护。历经近半个世纪的人工繁育保护, 其种群数量得到一定的提升, 但是由于性成熟周期较长(雌性成年个体约需8—10年、体长1.5 m、体重约36 kg)等原因, 能繁殖成年个体种质资源尤为珍贵。近年来, 扬子鳄的多父性交配体系[2]、精子储存[3]和卵黄发生等繁殖特性已逐渐被人们认知, 但其在性腺发育早期的配子发生进程则很少有人关注。原始卵泡的形成和发育直接影响到雌性动物生育阶段的可用卵泡数量, 是雌性动物繁殖阶段中可利用的全部资源[4], 其在重点保护物种的标签下能繁殖的成年个体种质资源更显珍贵。但至今未见有关鳄目动物卵巢中卵母细胞巢形成、裂解及原始卵泡形成过程和分子机制系统的报道。如何通过原始卵泡库资源的有效调控, 追求其终生生殖配子的利用最大化, 始终是扬子鳄人工繁育与物种保护进程所面临的重要课题之一。

1989年, 科学家利用染色体步移法在果蝇中克隆到一个控制胚胎头部正常发育的基因Forkhead(FKH), 并证明该基因的编码蛋白是细胞核中的一种转录调节因子[5, 6]。随后, 人们在小鼠(Mus musculus)、线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪瞻(Xenopus tropicalis)、酵母(Candida marina)和人(Homo sapiens)等几乎所有真核生物中也都陆续发现这类具有保守序列的蛋白或转录因子, 并将其统一命名为Fox基因[7]。其中FoxO(Forkhead boxclass O)是研究最多的亚族之一, 且已被证实作为在细胞核与细胞质之间穿梭的转录因子, 通过调节凋亡、细胞周期、细胞分化、DNA修复、应激抵抗、长寿、葡萄糖代谢及肌肉生长等相关基因的表达, 发挥了广泛的生物学效应[8]。目前FoxO转录因子只有4个家族成员, 分别为FoxO1(FKHR)、FoxO3a(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6, 尽管所有哺乳动物的FoxO家族都包含这4个成员, 但它们的编码基因及染色体定位在不同物种中有很大差异[9]。 FoxO蛋白是细胞存活的负调节因子, 通过抑制细胞増殖、细胞凋亡或促进细胞周期阻滞等机制调控哺乳动物的生殖细胞发育[10]。哺乳动物卵巢中含有大量处于不同发育阶段的卵泡, 卵泡的发育既依赖于卵巢局部生长调控因子(如IGF-1和雌激素), 又依赖于垂体分泌的促性腺激素(FSH和LH)。经证明, 在雌性哺乳动物中FoxO蛋白可以通过多条通路对卵泡的生长、成熟和闭锁进行调控[11]。Richards等[12]最早发现, 大鼠卵巢中FoxO转录因子的表达和活性受IGF-1、雌激素及促性腺激素调控, 表明这些内分泌因素会影响FoxO功能的发挥。另有研究表明FoxO1-/-小鼠在出生前即死亡, 且值得注意的是, 所有雌性小鼠的卵巢都出现了全体卵泡激活发育的现象, 导致卵母细胞死亡、卵泡池过早耗尽和继发性不孕[13]。基于FoxO1在生殖系统和神经系统等中的重要性研究, 其序列已在大鼠和家鸡等模式动物或经济家畜动物中被成功克隆。然而, 截至目前, 少有扬子鳄相关研究中关于FoxO基因表达调控的报道。

本研究以初孵扬子鳄性腺组织作为材料, 通过对Forkhead box家族蛋白-1(FoxO1)基因CDS区序列的克隆分析; 结合免疫组织化学对FoxO1蛋白在初孵鳄性腺复合体、胃、肠和肺脏等组织表达谱进行研究; 利用免疫荧光和Western Blot技术对不同出壳后日龄(17d、63d和96d)雌鳄性腺组织中的FoxO1基因的蛋白质丰度进行定位和定量研究。相关结果将为系统解析FoxO1蛋白在扬子鳄卵子发生过程中的生物学功能提供参考, 对于丰富扬子鳄卵子发生调控机制具有重要的生殖生物学理论研究价值。

1    材料与方法

1.1    材料

分别取来自安徽省宣城市扬子鳄繁殖研究中心的17日龄、63日龄和96日龄3只初孵扬子鳄, 迅速断头处死, 解剖取一部分幼鳄性腺组织液氮保存–80℃备用; 另取其性腺、胃、大肠和肺等外周组织, 经多聚甲醛固定液处理后, 无水乙醇梯度脱水, 透明、石蜡包埋, 用切片机连续切片(厚约6 µm), 于水浴锅45℃清水展片并固定于洁净载玻片上, 于60℃展烘箱中烘干2h, 可直接用于后续的研究。上述行为均得到了安徽师范大学动物伦理委员会的批准。

1.2    方法

总RNA的提取与cDNA的合成  取−80℃冻存的幼鳄性腺组织按TRIzol抽提方法, 获得总RNA, 并测其浓度(OD值在1.6—1.8)、纯度及完整度后, 参照TaKaRa公司反转录试剂盒操作说明合成cDNA待用。

FoxO1基因cDNA序列的扩增  通过NCBI在鳄目中查找高度同源序列(登录号: KY713605), 运用Primer 5.0软件设计4对特异性引物(表 1), 以cDNA为模板进行PCR(35个循环, 每个循环94℃, 30s; 55℃, 30s; 72℃, 30s; 72℃终止延伸10min)。PCR产物经1%琼脂糖凝胶验证条带大小与引物设计条带相符后, 送通用生物(安徽滁州)公司进行测序并拼接后获得扬子FoxO1基因的完整CDS区序列。随后利用DNAMAN软件将测序得到的序列与在基因文库中查找到的序列进行同源性比对分析, 构建系统进化树。

表1 引物序列信息 Table1. Information of primers sequences
引物Primer引物序列Sequence (5′—3′)产物大小Product size (bp)
CDS-1FCAATGGAACTCAATCCGTCA427
CDS-1RGATGGAGGGTATGACATAGGG
CDS-2FTCAGGCCAGGAAGGAAATGG588
CDS-2RTGTGGGTAGGAGAATCAGAAGTCAGT
CDS-3FACAAGCACCAGGTTATTCATTT539
CDS-3RGCATAAGGGTTCATAGTATTCATC
CDS-4FTCCTCAGCCCAGTGGTAGAGTATTG520
CDS-4RAGCCTGACACCCAACTATGTGTGGT
表1 引物序列信息
Table1. Information of primers sequences

免疫组化染色  石蜡切片脱蜡脱水, 置于0.3%过氧化氢: 甲醇混合溶液中孵育30min, 清除内源性过氧化物酶, 组织打孔后置于抗原修复液中微波加热至沸腾, 滴加封闭液, 孵育兔源FoxO1一抗(Bioss, bs-9439R, 1﹕300), 置于4℃冰箱过夜, 室温孵育二抗(羊抗兔, 1﹕500)1.5h后, 用DAB试剂盒染色, 苏木素复染, 脱水透明封片, 光镜下观察并摄片。空白对照以PBS代替。

免疫荧光染色  石蜡切片脱蜡脱水, 置于0.3%过氧化氢: 甲醇混合溶液中孵育30min, 清除内源性过氧化物酶, 组织打孔后置于抗原修复液中微波加热至沸腾, 滴加封闭液, 孵育兔源FoxO1一抗(Bioss, bs-9439R ,1﹕200), 置于4℃冰箱过夜, 37℃避光孵育二抗(羊抗兔, 1﹕500)1.5h后, 用DAPI避光复染细胞核, 用抗荧光淬灭剂封片液封片、光镜下观察并摄片。

Western Blot  取−80℃冻存的17日龄、63日龄和96日龄幼鳄性腺复合体组织, 按RIPA裂解液抽提方法, 获得总蛋白质, 经SDS-PAGE电泳后将FoxO1及GAPDH内参蛋白目的条带转膜至PVDF膜上, 封闭后, FoxO1目的条带孵育兔源FoxO1一抗(Bioss, bs-9439R, 5%脱脂奶粉1﹕1000稀释), GAPDH内参蛋白条带孵育鼠源GAPDH一抗(Bioss, D110016-0025, 1﹕2000), 在4℃条件下摇床过夜, 在室温条件下孵育二抗(5%脱脂奶粉1﹕2000稀释)2h, 用高灵敏ECL发光试剂盒进行显影观察并摄片。

2    结果

2.1    扬子鳄FoxO1基因CDS区序列的克隆

经TA克隆测序和序列的拼接获得长度为1941 bp的核苷酸片段、预测编码646个氨基酸残基, 蛋白理化预测分析表明扬子鳄FoxO1蛋白等电点(isoelectric point; pI)和分子量(Mw)分别为4.88和162 kD。

2.2    FoxO1氨基酸序列同源性比对及构建进化树

通过将扬子鳄FoxO1基因的CDS区序列编码的氨基酸序列与湾鳄(XP_019412112)、恒河鳄(XP_019359603)、密西西比短吻鳄(XP_014461938)、中华鳖(XP_014424549)、西部锦龟(XP_005285222)、原矛头蝮(XP_015673988)、多疣壁虎(XP_015283276)、热带爪蟾(NP_001107165)、青鳉(NP_001098169)、小家鼠(AAI16898)、褐家鼠(XP_006252158)、智人(AAI26438)、原鸡(NP_001074346)和斑胸草雀(ACK57931)的FoxO1蛋白及扬子鳄FoxO4蛋白的氨基酸序列进行同源性比对后, 发现扬子鳄的FoxO1基因的CDS区序列编码的氨基酸序列与密河鳄等鳄目物种同源性为96.74%—92.21%; 与西部锦龟(85.87%)、中华鳖(85.34%)、原鸡(85.65%)和斑胸草雀(85.02%)等物种的氨基酸同源性次之; 与智人(75.58%)、小家鼠(74.96%)、褐家鼠(74.81%)、热带爪蟾(72.79%)、壁虎(69.95%)和原矛头蝮(68.61%)具有中等同源性; 而与青鳉的氨基酸同源性最低只有51.64%。此外, 经与扬子鳄FoxO4基因CDS区序列编码的氨基酸比对发现两者同源性仅为37.08%, 侧面佐证所克隆序列确实为扬子鳄FoxO1基因编码序列。

利用DNAman软件构建脊椎动物FoxO1基因的分子进化树结果表明(图 1), 扬子鳄首先鳄目动物聚为一小类、再与斑胸草雀聚为第一大类、其他爬行类物种聚为第二大类, 提示鳄目物种FoxO1基因与鸟类的亲缘关系相较中华鳖和原矛头蝮等爬行动物更近。在其他脊柱动物中, 哺乳动物、硬骨鱼和两栖物种也各自聚类称为子群, 表明FoxO1兼具功能保守性和种间特异性。

图1 扬子鳄FoxO1基因氨基酸序列系统进化树 Figure1. Phylogenetic tree of amino acid sequence of FoxO1 gene in Alligator sinensis

2.3    免疫组织化学结果

FoxO1 mRNA在初孵扬子鳄性腺复合体和外周组织的表达谱结果如图 2所示, 在初孵扬子鳄外周组织中FoxO1 mRNA表达情况为在大肠、肺脏和胃组织中有强或较强的表达, 在性腺复合体中有强表达。FoxO1蛋白在初孵扬子鳄性腺复合体和外周组织中的免疫组织化学结果如图 3所示, 在光镜下, 肾上腺小体由类固醇生成细胞群和嗜铬细胞群组成。类固醇生成细胞群位于肾上腺小体周围, 细胞排列紧密、成索团状分布、细胞呈立方形或柱状, 胞质染色浅、呈网络状, 细胞核呈圆形或卵圆形、位于细胞中央、染色深。结果表明FoxO1蛋白在性腺复合体的皮质部、髓质部和肾上腺部位均有表达, 在性腺复合体中, FoxO1蛋白在肾上腺类固醇合成细胞中强表达, 在性腺皮质部表达量显著高于髓质部(髓质与皮质部的间隔用虚线表示), 且其在性腺皮质部中的表达主要位于前体颗粒细胞(颗粒细胞核型呈卵圆形、前体颗粒细胞核型呈立方或不规则形)。其中肾上腺类固醇合成细胞和嗜铬细胞中均呈强表达(图 2B), 性腺皮质部的表达量显著高于髓质部且其在性腺皮质部中的表达主要位于前体颗粒细胞和卵母细胞(图 2C); FoxO1蛋白在肺间质中有较强表达, 肺泡外围细胞有强表达(图 2D); FoxO1蛋白在大肠内纵肌层及外纵肌层部分细胞有表达(图 2E); 黏膜肌层部分细胞团及大肠绒毛上皮有分布均匀的较强表达(图 2F); FoxO1蛋白在胃体的浆膜层、黏膜下层和环肌层均有较强表达(图 2G)。

图2 FoxO1在扬子鳄外周组织中的时空表达规律 Figure2. Temporal and spatial expression of FoxO1 in the peripheral tissues of Alligator sinensis

2.4    FoxO1蛋白在不同出壳后日龄雌性扬子鳄性腺复合体中的时空变化规律

分别以17、63和96日龄雌性扬子鳄性腺复合体组织为对象, 对FoxO1蛋白的免疫荧光信号定位情况进行检测。如图 3所示, FoxO1蛋白在不同时期性腺组织中的免疫阳性信号在性腺皮质部、髓质部中、中肾和肾上腺等处均有不同程度表达, 但其表达模式存在时期差异。17日龄性腺组织中的FoxO1主要表达于肾上腺和中肾区, 且显著高于63日龄和96日龄的性腺组织相应区域。FoxO1在17日龄性腺皮质部表达量极微弱, 随着性腺发育过程表达逐渐上调, 在63日龄性腺皮质部呈无规则随机分布, 在96日龄性腺皮质部中, 其荧光信号分布趋向于卵母细胞发育程度更高的位置。荧光定量结果表明17、63和96日龄性腺组织中的FoxO1基因mRNA丰度差异不显著, 与此不同Western blot结果表明: 17、63和96日龄性腺组织中的FoxO1表达量呈先上升后下降的变化模式, 表现为63日龄FoxO1基因表达量显著高于17日龄和96日龄。

图3 FoxO1在扬子鳄性腺组织中的时空表达规律 Figure3. Temporal and spatial expression of FoxO1 in the ovarian tissues of Chinese Alligator

3    讨论

3.1    Forkhead box (Fox)蛋白家族的发现及其生物学功能

Forkhead box (Fox)蛋白家族因能引起果蝇“叉头”突变而得名, 是一类DNA结合域具有翼状螺旋结构的转录因子, 通过与靶基因启动子中的叉头转录因子识别位点结合, 进一步抑制或激活相关靶基因的转录从而发挥生物学功能。Fox含19个亚家族, 其中作为研究最为透彻的FoxO亚家族中成员中高度同源的FoxO1FoxO3FoxO4FoxO6四个亚型, 已被证实在哺乳动物[14]和秀丽线虫[15]等低等生物中广泛存在。FoxO1是进化上保守的叉头转录因子FoxO亚家族的成员, 有研究发现其在胰岛素和生长因子对葡萄糖稳态和细胞分化等生命活动的影响过程中发挥重要作用[16], 且对葡萄糖代谢、细胞周期调控、细胞凋亡和氧化应激抵抗等过程也发挥重要影响。近年来对 FoxO1 的研究大多集中于小鼠、猪、牛、羊等哺乳动物, 尚未见关于该基因的序列和功能在鳄目动物中的相关报道。本研究通过扬子鳄FoxO1编码区序列的克隆和序列特征分析, 检测其在外周组织中的表达分布, 结合其在性腺早期发育过程中的时空变化规律研究进一步探究其在扬子鳄卵子发生进程中的功能。

FoxO1是FoxO亚家族中发现最早的成员, 其与成肌细胞分化及脂肪细胞代谢有关, 并作为潜在因子参与骨骼肌的分化及Ⅰ型肌纤维基因的表达, 因此是研究肌肉及脂肪组织发育和代谢的重要候选因子[17]FoxO1对肌细胞的分化及脂肪细胞的代谢有着一定的作用, 其能促进脂细胞的分化[18]、影响骨骼肌的生长发育[19]和Ⅰ型肌纤维基因的表达[20]。大量研究表明FoxO转录因子也是控制胚胎发生的重要物质, 对所有的胚原基层和器官的发育都是必需的[21]。在哺乳动物中, FoxO亚家族中的FoxO1FoxO3FoxO4 广泛表达于全身组织, 而FoxO6主要表达在脑的特定区域[22]。由此可推断其在动物的生长发育方面也发挥了重要作用。杨燕军[17]研究发现FoxO1基因在初生猪(1日龄)和成年猪(9月龄)的肝、肺、肾、脾、心、胃、皮下脂肪、肌肉等组织中均有表达, 只是表达丰度随发育阶段和组织的不同而具有差异。王玲[23]研究发现FoxO1基因在新生犊牛各个组织中如腹内脂肪、小肠淋巴结、肺、脾、胸腺、胃、肾、肝和心均有表达, 但在不同组织中的表达量有差异, 这可能与FoxO1基因在有机体各组织器官中的生物学效应有关。本实验发现FoxO1蛋白在初孵鳄肺、胃和大肠中均有较强或强表达, 说明其在初孵鳄的生长、代谢中可能有着某些特定的功能, 如促进组织的生长发育与成熟、直接或间接介导各组织的协调工作等。但是对扬子鳄的相关研究尚未取得足够证据, 相关问题仍需更多的研究去发现。

3.2    Forkhead Box (Fox)蛋白家族在雌性生殖系统中的功能报道

FoxO1在许多细胞类型中表达并参与了包括细胞增殖、凋亡、自噬和氧化应激抵抗在内的诸多生物学过程[24], 其中FoxO1已被证实能够通过影响卵巢卵泡的启动、发育、成熟及闭锁过程影响动物的繁殖性能。有研究指出FoxO1在多种哺乳动物的卵泡中均有表达, 也有研究发现, FoxO1 mRNA在卵巢中表达丰富[25], 此外, 对香猪[26]的卵巢卵泡细胞进行免疫组化时发现FoxO1在香猪卵泡的多个发育阶段的颗粒细胞细胞质中都有表达; 在原始卵泡、次级卵泡和三级卵泡中颗粒细胞的表达弱; 在大腔卵泡的颗粒细胞细胞质中有较强的表达; 在闭锁卵泡的颗粒细胞中的表达强度减弱; 凋亡颗粒细胞中没有检测到FoxO1的表达且有随卵泡发育逐渐增强的趋势。Tarnawa等[27]对多种哺乳动物使用免疫组化方法进行实验, 发现FoxO1在不同动物卵泡的不同发育阶段的颗粒细胞中表达情况均不同, 表现为原始卵泡前体颗粒细胞不表达, 而在发育中及更高级发育卵泡颗粒细胞中特异表达。还有研究表明, FoxO1对小鼠[15]、牛[23]的卵泡细胞的凋亡起到促进作用, 过表达 FoxO1后发现小鼠卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著增加。以上研究结果表明FoxO1 对目前已知的部分哺乳动物的卵泡发育具有一定的调控作用。卵巢实质是由外周的皮质和中央的髓质构成, 皮质部中含有不同发育阶段的卵泡。本研究发现FoxO1蛋白在初孵扬子鳄的性腺组织的皮质部及髓质部均有表达且皮质部表达量明显高于髓质, 皮质部中主要表达于前体颗粒细胞, 这与毛文智等[28]在小尾寒羊的研究中指出卵泡闭锁进程易发生于如次级卵泡和三级卵泡这两类发育程度较高的卵泡中, 申明[15]以小鼠为研究对象得出FoxO1的高表达就会导致颗粒细胞的凋亡与卵泡闭锁的结论相呼应, 皮质部中含有颗粒细胞以及发育程度较高的卵泡, 故FoxO1在皮质部有较高表达。在本研究中还发现FoxO1蛋白在性腺组织中的表达模式存在着时期差异, 在扬子鳄性腺发育进程中, FoxO1的表达逐渐趋向于卵母细胞发育程度更高的位置, 这与上文中所提到的多种哺乳动物不同发育阶段卵泡颗粒细胞中表达情况的结果相接近[27]。由此猜想其对卵泡及其周围组织的发育成熟具有一定影响, 可以推测FoxO1在爬行动物扬子鳄和其他哺乳动物的卵母细胞发育、颗粒细胞的增殖和凋亡以及卵泡闭锁过程中扮演着重要的角色, 说明FoxO1 在扬子鳄和其他哺乳动物的生殖生理调控方面发挥了一定的作用, 但是其调控机理还有待进一步研究。后续继续追踪FoxO1蛋白在雌性扬子鳄性腺发育各个阶段的定位、迁移及定量表达信息并结合FoxO1蛋白编码基因层面的相关分析, 可对FoxO1蛋白对扬子鳄性腺发育的影响有更深层的发现。

3.3    Forkhead Box (Fox)蛋白家族在雌性卵子发生过程中的功能报道

哺乳动物卵巢内卵子发生过程受到多种因素的影响, 如内分泌、旁分泌、自身调节因子及环境等的协同作用。Richards等[12]最早发现, 大鼠卵巢中FoxO转录因子的表达和活性受IGF-1、雌激素及促性腺激素调控, 表明这些内分泌因素会影响FoxO功能的发挥, 国内的研究者腾云以小鼠为研究对象发现FSH对闭锁卵泡中FoxO1的表达有明显的抑制作用[11], 进一步证实了Richards等[12]的结论。FoxO1磷酸化的抑制能增强离体培养小鼠颗粒细胞周期调节因子PCNACcnd-2基因的表达, 进而阻滞细胞发生凋亡[29], 而这一过程也是FSH通过AKT/FoxO1信号通路调控相关下游靶基因的转录水平完成的。可以说明, FoxO1基因的表达水平与体内激素、信号通路等密切相关。本研究对17、63和96日龄雌性扬子鳄性腺复合体FoxO1 mRNA进行了荧光定量PCR检测, 实验结果表明17、63和96日龄性腺组织中的FoxO1基因mRNA丰度差异不显著。同时对这3个时期的雌性扬子鳄性腺复合体FoxO1蛋白进行Western blot半定量检测, 实验结果表明FoxO1蛋白在初孵扬子鳄性腺组织中的表达量存在着时期差异。17、63和96日龄性腺组织中的FoxO1表达量呈先上升后下降的变化模式, 表现为63日龄FoxO1基因表达量显著高于17日龄和96日龄。荧光定量PCR和 Western Blot结果存在差异, 可能原因分析如下两点: (1)所研究的基因可能存在着转录后修饰; (2)所取实验材料均为实验室前期所培养孵化的扬子鳄, 在不同的卵子发生时期过程中的性腺复合体组织, 染色质结构会在配子发生过程中发生显著的变化, 其相关基因的转录活性也会发生相应的改变; 而在染色质重构和基因转录调节中表观遗传修饰发挥了不可或缺的重要的作用, 据此可以推测, 在扬子鳄的配子发生发育过程中, 表观遗传信息有可能发生了较大的变化。FoxO1与颗粒细胞上FSH 受体密切相关, 鉴于FoxO1作为信号通路中的关键一员, 其表达量变化及与上下游基因的相互作用对卵子发生过程中有重要影响。在个体发育过程中, 其表达量水平会发生一定变化, 呈现一定的时期差异, 但是其变化原因还有待进一步研究。推测随着扬子鳄的发育, 体内有关雌性激素发生变化, 从而导致FoxO1转录因子的表达量发生变化, 进而调控雌性生殖生理过程。然而, 参与卵子发生过程中的一些信号通路, 尤其是一些新的信号转导通路及其调节机制仍不明确, 探索这些信号通路在卵子发生, 以及FoxO1在扬子鳄生殖生理调控中的分子机制仍将是今后研究的热点。

图1 扬子鳄FoxO1基因氨基酸序列系统进化树 Figure1. Phylogenetic tree of amino acid sequence of FoxO1 gene in Alligator sinensis
图2 FoxO1在扬子鳄外周组织中的时空表达规律 Figure2. Temporal and spatial expression of FoxO1 in the peripheral tissues of Alligator sinensis
图3 FoxO1在扬子鳄性腺组织中的时空表达规律 Figure3. Temporal and spatial expression of FoxO1 in the ovarian tissues of Chinese Alligator
表1 引物序列信息 Table1 Information of primers sequences
引物Primer引物序列Sequence (5′—3′)产物大小Product size (bp)
CDS-1FCAATGGAACTCAATCCGTCA427
CDS-1RGATGGAGGGTATGACATAGGG
CDS-2FTCAGGCCAGGAAGGAAATGG588
CDS-2RTGTGGGTAGGAGAATCAGAAGTCAGT
CDS-3FACAAGCACCAGGTTATTCATTT539
CDS-3RGCATAAGGGTTCATAGTATTCATC
CDS-4FTCCTCAGCCCAGTGGTAGAGTATTG520
CDS-4RAGCCTGACACCCAACTATGTGTGGT

参考文献

[1] 王立德, 吴孝兵. 中国扬子鳄保护存在的主要问题及管理对策研究 [J]. 阜阳师范学院学报(自然科学版), 2010, 27(3): 58-61.Wang L D, Wu X B. Research on major problems in conservation of Chinese Alligator sinensis and management strategies [J]. Journal of Fuyang Teachers College (Natural Science), 2010, 27(3): 58-61.
[2] 汪焕. 扬子鳄饲养种群交配体系及对种群遗传多样性的影响 [D]. 芜湖: 安徽师范大学, 2018: 31-46.Wang H. The mating system and its influence on the genetic diversity of the Chinese Alligator sinensis [D]. Wuhu: Anhui Normal University, 2018: 31-46.
[3] 吴梦娟. 雌性扬子鳄输卵管季节性变化及精子储存机理的探究 [D]. 芜湖: 安徽师范大学, 2019: 45-48.Wu M J. Study on seasonal changes of the structure of oviduct and sperm storage mechanism in female Chinese Alligator [D]. Wuhu: Anhui Normal University, 2019: 45-48.
[4] Johnson J, Canning J, Kaneko T, et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary [J]. Nature, 2004, 428(6979): 145-150.
[5] Weigel D, Jürgens G, Küttner F, et al. The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo [J]. Cell, 1989, 57(4): 645-658.
[6] 张毅芳. FOXO1子宫内膜样腺癌中的表达及对癌细胞生物学行为的影响和机制研究 [D]. 济南: 山东大学, 2017: 52-54.Zhang Y F. FOXO1 expression in endometrioid carcinoma and the influence and mechanisum of FOXO1 on the biological behaviorr of endometrial cancer cells. [D]. Jinan: Shandong University, 2017: 52-54
[7] Wijchers P J E C, Burbach J P H, Smidt M P. In control of biology: of mice, men and Foxes [J]. The Biochemical Journal, 2006, 397(2): 233-246.
[8] Huang H, Tindall D J. Dynamic FoxO transcription factors [J]. Journal of Cell Science, 2007, 120(Pt 15): 2479-2487.
[9] Barthel A, Schmoll D, Unterman T G. FoxO proteins in insulin action and metabolism [J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2005, 16(4): 183-189.
[10] Accili D, Arden K C. FoxOs at the crossroads of cellular metabolism, differentiation, and transformation [J]. Cell, 2004, 117(4): 421-426.
[11] 滕云. 小鼠排卵前卵泡闭锁过程中FSH对FOXO1基因的表达调控 [D]. 南京: 南京农业大学, 2013: 71-73.Teng Y. FOXO1Is regulated by fsh in the mouse preovulatory follicular atresia process [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2013: 71-73.
[12] Richards J S, Sharma S C, A E Falender, et al. Expression of FKHR, FKHRL1, and AFX genes in the rodent ovary: evidence for regulation by IGF-I, estrogen, and the gonadotropins [J]. Molecular Endocrinology, 2002, 16(3): 580-599.
[13] Nakae J, Biggs W H, Kitamura T, et al. Regulation of insulin action and pancreatic β-cell function by mutated alleles of the gene encoding forkhead transcription factor Foxo1 [J]. Nature Genetics, 2002, 32(2): 245-253.
[14] Birkenkamp K U, Coffer P J. FOXO transcription factors as regulators of immune homeostasis: molecules to die for [J]? The Journal of Immunology, 2003, 171(4): 1623-1629.
[15] 申明. Foxo1对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的调控研究 [D]. 南京: 南京农业大学, 2014: 39-66.Shen M. FOXO1-dependent regulation of apoptosis in mouse ovarian granulosa cells [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2014: 39-66.
[16] Pang W, Sun S, Bai L, et al. Molecular cloning and expression of forkhead transcription factor O1 gene from pig Sus scrofa [J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2008, 21(4): 499-509.
[17] 杨燕军. 猪FoxO1基因cDNA的克隆及其组织表达研究 [D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2007: 23-39.Yang Y J. cDNA cloning and tissue expression of Foxo1 in pig [D]. Yangling: Northwest A & F University, 2007: 23-39.
[18] Kamei Y, Miura S, Suzuki M, et al. Skeletal muscle FOXO1 (FKHR) transgenic mice have less skeletal muscle mass, down-regulated Type I (slow twitch/red muscle) fiber genes, and impaired glycemic control [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(39): 41114-41123.
[19] Allen D L, Unterman T G. Regulation of myostatin expression and myoblast differentiation by FoxO and SMAD transcription factors [J]. American Journal of Physiology Cell Physiology, 2007, 292(1): C188-C199.
[20] Kamagate A, Qu S, Perdomo G, et al. FoxO1 mediates insulin-dependent regulation of hepatic VLDL production in mice [J]. The Journal of Clinical Investigation, 2008, 118(6): 2347-2364.
[21] Brenkman A B, Burgering B M T. FoxO3a eggs on fertility and aging [J]. Trends in Molecular Medicine, 2003, 9(11): 464-467.
[22] 韩琦, 党文庆, 郭翔宇, 等. 绵羊卵巢卵泡FoxO1表达模式的研究 [J]. 中国畜牧杂志, 2020, 56(3): 70-75.Han Q, Dang W Q, Guo X Y, et al. Study on the expression pattern of FoxO1 in sheep ovarian follicles [J]. Chinese Journal of Animal Science, 2020, 56(3): 70-75.
[23] 王玲, 李健, 傅冲云, 等. 牛FoxO1基因的cDNA克隆及在新生犊牛组织中的表达分析 [J]. 中国畜牧杂志, 2010, 46(13): 1-5.Wang L, Li J, Fu C Y, et al. cDNA cloning of cattle FoxO1 gene and expression analysis in newborn calf tissues [J]. Chinese Journal of Animal Science, 2010, 46(13): 1-5.
[24] 陈小玲, 黄志清, 毛湘冰等. FoxO1的功能研究进展 [J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(9): 90-93.Chen X L, Huang Z Q, Mao X B, et al. Research progress on the function of FoxO1 [J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2011, 38(9): 90-93.
[25] Biggs Ⅲ W H, CaveneeKaren C W K. Identification and characterization of members of the FKHR (FOX O) subclass of winged-helix transcription factors in the mouse [J]. Mammalian Genome, 2001, 12(6): 416-425.
[26] 孟春花. 香猪卵巢细胞生物学特性和影响母猪卵巢颗粒细胞体外成熟的因素探讨 [D]. 南京: 南京农业大学, 2008: 39-55.Meng C H. Investigation on the biological characters of ovarian cells of Xiang pig and factors affect maturation of porcine granulosa cells in vitro [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2008: 39-55.
[27] Tarnawa E D, Baker M D, Aloisio G M, et al. Gonadal expression of Foxo1, but not Foxo3, is conserved in diverse mammalian species [J]. Biology of Reproduction, 2013, 88(4): 103,1-11.
[28] 毛文智, 陈洋, 常青, 等. 小尾寒羊卵巢的组织结构特点 [J]. 草食家畜, 2011(1): 34-38.Mao W Z, Chen Y, Chang Q, et al. Histologic observation of ovary in tail Han sheep [J]. Grass-Feeding Livestock, 2011(1): 34-38.
[29] Park Y, Maizels E T, Feiger Z J, et al. Induction of cyclin D2 in rat granulosa cells requires FSH-dependent relief from FOXO1 repression coupled with positive signals from smad [J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(10): 9135-9148.

相关文章

[1] 陈晶, 聂青, 刘妍. 《WHO基本药物示范目录》与我国《国家基本药物目录》动态调整程序比较与借鉴.水产学报,2015(3): 289-293.doi:10.3866/PKU.WHXB201503022
  • 导出引用
  • 下载XML
  • 收藏文章
计量
  • 文章下载量()
  • 文章访问量()

目录

扬子鳄FoxO1基因CDS序列的克隆及其在初孵鳄性腺组织的时空表达规律