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2022, 46(6): 1018-1026. doi: 10.11964/jfc.20211013098

基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

1. 西南大学水产学院,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆    400715

2. 浙江海洋大学,国家海洋设施养殖工程技术研究中心,浙江 舟山    316022

通讯作者: 何文平, hewenping2008@163.com

收稿日期:2021-10-09
修回日期:2021-10-24

基金项目:   国家自然科学基金 (32071651);重庆市自然科学基金 (cstc2020jcyj-msxmX0438);重庆市社会民生科技创新专项 (cstc2016shmszx80087);中央高校基本科研业务费专项 (XDJK2019C025) 

关键词: 岩原鲤 , 环境DNA , 引物 , 探针 , 生物量

Detection and biomass assessment of Procypris rabaudi based on environmental DNA

1. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, College of Fisheries, Southwest University, Chongqing 400715, China

2. National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan    316022, China

Corresponding author: Wenping HE, hewenping2008@163.com

Received Date:2021-10-09
Accepted Date:2021-10-24

Keywords: Procypris rabaudi , environmental DNA , primers , probe , biomass

为建立岩原鲤基于环境DNA (eDNA)的实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨eDNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用 PCR 扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入 pMD19-T载体,构建重组质粒作为 qPCR 标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行 qPCR 扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤 qPCR 检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示,引物和 TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR 的阈值循环数 (Ct)与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数 (R2) 达到 0.999,检测限位DNA浓度为5×10−6 ng/μL,扩增效率为94.7%;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中 eDNA浓度,目标 DNA 浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性 (R2=0.957),得到岩原鲤DNA 浓度与其个体数量的相关性曲线:y = 131 546x + 77 623;去除岩原鲤后, eDNA的拷贝数与时间负相关,其在水体环境中的存留时间为17 d。研究表明,该岩原鲤 eDNA引物和TaqMan探针既能应用于水体中岩原鲤的定性检测,特异性高、时效性好;又能定量检测出环境中岩原鲤的密度,有利于反映岩原鲤在不同采样点的生物量及时空动态,从而为评价岩原鲤人工放流效果和管理保护资源提供参考。

Species distribution and biomass are the basis for evaluating population dynamics and community structure in an ecosystem. Unfortunately, it is frequently full of challenges to capture the distribution of the rare species through traditional methods. Procypris rabaudi is a unique economic species in the upper reaches of the Yangtze River, the number of which has declined dramatically in recent years. Environmental DNA technology is a sensitive, low-cost and non-invasive new technology for species monitoring. It has great potential application in detecting endangered and invasive species. In order to establish a real-time quantitative PCR (qPCR) method for the detection of P. rabaudi and distinguish it from other fishes in the Yangtze River, this study designed eDNA primers and a TaqMan probe based on 12S rRNA gene sequence in mtDNA. The sequence of the 12S rRNA gene was amplified by PCR and cloned into the pMD19-T vector to construct the standard plasmid, and a qPCR method was developed for detection of P. rabaudi using serially diluted standard plasmid as templates. Subsequently the sensitivity, specificity and application effects of the method were evaluated. The results showed that the cycle threshold value (Ct) of qPCR assay had a great linear relationship with the copy number of the standard plasmid. Amplification specificity analysis indicated that the method could specifically detect P. rabaudi. Then, eDNA was detected in the water samples in aquarium tanks with different numbers of P. rabaudi, The target DNA concentration and the number of P. rabaudi had a positive correlation of R2 was 0.957, and the correlation curve between DNA concentration and the individual number was obtained: y = 131 546x + 77 623. In addition, after the removal of P. rabaudi, the copies of eDNA were negatively correlated with time, and its retention time in the water environment was about 17 days. In this study, we found that the DNA primer and Taqman probe could be applied to the qualitative detection of P. rabaudi in water with high specificity, as well as estimate fish density in tanks quantitatively. These results demonstrate that eDNA analysis method is a potential tool to reflect the biomass of P. rabaudi in different sampling sites, which can provide a basis for assessment of artificial release effect and resource management of P. rabaudi in the future.

岩原鲤 (Procypris rabaudi)俗称黑鲤或岩鲤,隶属于鲤形目 (Cypriniformes)鲤科 (Cyprinidae)原鲤属 (Procypris),主要分布在长江上游和金沙江中下游。岩原鲤属于中国特有物种,其肉质细嫩鲜美、含肉率高、无肌间刺,是人们喜爱的名优经济鱼类。但由于捕捞过度和水域环境污染,自20世纪70年代以来,其野生资源急剧减少,已被列为易危物种[1]和濒危鱼类[2]。岩原鲤野生种群在2021年被《国家重点保护野生动物名录》列为二级保护动物,是我国重要的水产种质资源和遗传物种基因库。监测种群的密度和分布是濒危物种保护的一个重要组成部分[3-4]。鱼类监测通常是基于直接捕获、电捕鱼、诱捕和视觉观察获得数据,而岩原鲤多栖息于底质多岩石的深水底部,难于捕获或观察,影响鉴定准确率;长江干流自2020年起禁止捕捞十年,使得直接监测和评估岩原鲤种群愈发困难。因此应采用破坏性较小的调查方法,改善对受保护物种的生态监测,并评估种群的现状。

环境DNA (eDNA)技术是基于环境样本,如土壤、空气或水,以确定是否有目标物种的DNA存在,而不需要直接取样个体[5]。直接从水体和沉积物样本中提取的DNA含有脱落细胞、卵子和幼体,这些在常规调查中可能被忽视。因此,这是一种非常适合罕见或濒危物种的非侵入性取样方法,已成功应用于不同水生系统中的多个物种[6-8]。对于鱼类群落,有研究表明eDNA方法可以在湖泊或河流调查中对传统采样方法起到补充作用[9]。此外,eDNA分析需要更少的采样工作,其成本可能比传统方法低67%[10]。eDNA的检测可以基于标准PCR,在凝胶电泳上可视化,或使用更敏感的定量PCR方法[11]。水样中eDNA检测的2种最常见方法:①通过实时荧光定量PCR (qPCR)[12],使用特定特异性引物和探针进行单物种检测;②使用针对短线粒体DNA条形码区-eDNA元编码通用引物对eDNA进行PCR扩增后,通过高通量测序 (NGS)进行多物种检测[13-14]。水样eDNA浓度的测量既具有成本效益又是一种无破坏性的方法,许多研究使用定量PCR方法 (qPCR)来量化鱼类种群的丰度[15-17]。截至目前,尚未开发出对岩原鲤特异的eDNA 引物或探针,也没有研究报道岩原鲤eDNA浓度与生物量的关系。为了确定eDNA信号的时空尺度,并准确估计物种在环境中的存在/缺失和丰度,了解eDNA的持久性和降解过程非常重要。

实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列,设计引物和特异性探针,建立岩原鲤qPCR检测方法,以达到快速检测岩原鲤,并在长江鱼类中准确区分岩原鲤的目的;另外,探讨了岩原鲤eDNA浓度与生物量的关系以及eDNA在水中的降解时间。

1    材料与方法

1.1    岩原鲤特异性引物及探针的设计与验证

设计引物和探针

根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列 (GenBank: EU082030.1;www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank),使用Primer Express 3.0.1软件设计岩原鲤引物YYLF1/ YYLR1和探针YYL-MGB1 (表1),引物和探针由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。qPCR探针5'用6-FAM (荧光素)进行标记,3′用MGB进行修饰。包括引物在内的总扩增子大小为149 bp。探针和引物序列与NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)的核苷酸数据库进行匹配,使用BLASTn评估岩原鲤序列特异性 (表2)。虽然岩原鲤和其他鱼类之间的12S rRNA普遍缺乏种间变异性,但探针上至少有2个碱基不匹配。

表1 引物和探针 Table1. Primer and probe
名称
name
类型
type
长度/bp
length
引物/探针序列 (5′- 3′)
primer/probe sequence (5′-3′)
YYLF1 上游引物 forward primer 22 GAAGTGGGAAGAAATGGGCTAC
YYLR1 下游引物 reverse primer 18 GTGACGGGCGGTGTGTAC
YYL-MGB1 探针 probe 21 ATCATAGAACATCACGAACAT
表1 引物和探针
Table1. Primer and probe
表2 岩原鲤 TaqMan 探针与14种鱼类序列的比对结果 Table2. P. rabaudi TaqMan probe with comparison to the 14 kinds of fish DNA sequences
种名
species name
探针序列
probe sequence
岩原鲤
P. rabaudi
734 AT--CATAGAACATCACGAA-CAT 755

Carassius auratus
734 A---CATAGAATATTACGAA-CAT 755
黄颡鱼
Pelteobagrus fulvidraco
734 TACACATAGAATATTACGAATGA- 755
泥鳅
Misgurnus anguillicaudatus
734 TA--ATAAGAATATTACGGA-CA- 755
草鱼
Ctenopharyngodon idella
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755

Hypophthalmichthys molitrix
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755

Aristichthys nobilis
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755
麦穗鱼
Pseudorasbora parva
734 T---TATAGAATATTACGAATCAT 755

Cyprinus carpio
734 A---TATAGAATATTACGAA-CAT 755
长薄鳅
Leptobotia elongata
734 T---AATAGAATAACACGAA-CA- 755
齐口裂腹鱼
Schizothorax prenanti
734 TT--TATAGAATATTACGAA-CAT 755
青鱼
Mylopharyngodon piceus
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755
团头鲂
Megalobrama amblycephala
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755
乌原鲤
Procypris mera
734 G---CATAGAATATCACGAA-CAT 755
胭脂鱼
Myxocyprinus asiaticus
734 C---TGTAGAATAACACGAA-CA- 755
注:不匹配通过阴影突出显示
Notes: mismatches are highlighted by shading
表2 岩原鲤 TaqMan 探针与14种鱼类序列的比对结果
Table2. P. rabaudi TaqMan probe with comparison to the 14 kinds of fish DNA sequences
提取鱼类肌肉DNA

与其他鱼类进行体外试验,以确保该试验没有扩增出其他鱼类。取岩原鲤和其他鱼类肌肉 (表3)放入研钵中,加液氮研磨成粉末,用DNeasy ® Blood&Tissue Kit (Qiagen公司)提取样品肌肉DNA。实验用岩原鲤采自四川省农业科学院水产研究所宜宾基地,其他鱼类取自重庆市北碚区。

表3 样品具体信息 Table3. Sample specific information
DNA 样品名称
DNA sample ID
种名
species name
样品采集地
sample locality
YYL 岩原鲤  P. rabaudi 四川省宜宾市
Yibin, Sichuan
JY 鲫 C. auratus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
HSY 黄颡鱼 P. fulvidraco 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
NQ 泥鳅 M. anguillicaudatus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
HS 黄鳝 Monopterus albus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
LY 鲢 H. molitrix 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
YY 鳙 A. nobilis 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
BDCWH 斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
LiY 鲤 C. carpio 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
表3 样品具体信息
Table3. Sample specific information
实时荧光定量PCR检测

使用Bio-Rad伯乐CFX384 Touch荧光定量PCR仪,通过qPCR测定以上9个DNA样品。实时荧光定量PCR 扩增体系20 μL (生工生物工程上海股份有限公司2×TaqMan Fast qPCR Master Mix):2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL,DNA Buffer (Optional) 2 μL,上下游引物YYLF1/YYLR1 (10 μmol/L)各0.4 μL,YYL-MGB1探针 (10 μmol/L) 0.4 μL,DNA模板1.0 μL,超纯水补至20 μL。实时荧光定量PCR 扩增在Bio-rad CFX Connect PCR仪上进行。打开“Bio-Rad CFX Maestro”,设置PCR反应条件,两步法扩增反应程序:预变性94 °C 3 min;然后94 °C 5 s,60 °C 30 s 循环40 次。每个平板有3个阴性对照,以确保在qPCR平板的制备过程中没有发生污染。使用Bio-Rad CFX Maestro软件分析qPCR的结果。

1.2    岩原鲤重组质粒构建及引物与探针灵敏度测试

PCR 扩增12S rRNA基因片段

以岩原鲤肌肉DNA 为模板,PCR 扩增获得12S rRNA基因序列。扩增体系 (25 μL):ddH2O 9.5 μL,上下游引物各1.0 μL,模板1.0 μL,2× Es Taq Master Mix12.5 μL。PCR 扩增条件为: 94 °C预变性 5 min;94 °C变性 30 s, 58 °C退火 30 s, 72 °C 延伸 30 s,35 个循环;72 °C延伸 10 min;1.5% 琼脂糖凝胶电泳回收 DNA 产物。

重组质粒构建

将纯化后的PCR产物与pMD19-T载体相连,连接体系 (10 μL):目的基因4.0 μL,T载体1.0 μL,Solution Ⅰ 5.0 μL。连接条件:16 °C反应30 min。

将保存于−80 °C的大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰盒上,融化感受态细胞100 μL,然后加入10 μL连接产物,振荡混合均匀,置于冰中30 min。42 °C加热45 s,冰中放置1 min。加入890 μL无抗性LB液体培养基,37 °C、100 r/min摇床振荡培养60 min。用100 μL菌液涂布含有氨苄抗性的LB固体培养基。37 °C倒置培养过夜 (12~16 h)。

菌液PCR鉴定阳性克隆

将100 μL PCR鉴定为阳性的菌液接种于5 mL含氨苄抗性的LB液体培养基中,37 °C、150 r/min振荡过夜。取摇好的菌液400 μL与50%甘油管1∶1混合,制两管。一管送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序,另一管于−20 °C冰箱中保存。

分析公司反馈的测序结果,比对同源性。测序正确的阳性克隆菌和表达载体用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。采用Nanodrop 2000c核酸定量仪测定提取质粒的纯度与浓度。

岩原鲤特异性引物及探针的灵敏度测试

将YYL样品DNA构建的质粒进行8点连续稀释 (10∶1)。连续稀释液的浓度范围为5~5×10−7 ng/μL,编号1~8号,每个浓度 3 个重复,进行qPCR检测限位测试,拟合出岩原鲤DNA标准曲线。反应体系和程序同qPCR检测,模板为1 μL 10倍梯度稀释的质粒DNA。以连续稀释的质粒DNA为模板,测定qPCR检测的灵敏度。DNA拷贝数参考文献[18]的方法计算。此外,为了避免污染,在一个与qPCR程序不同的房间里进行上述qPCR标准品的制备和添加[19]

1.3    检测水生环境中岩原鲤含量以及eDNA降解

水样采集

本实验在北碚实验鱼池的500 L养殖桶中进行。用350 L曝气水作为水源,水温7 °C左右,分别在6个桶中放入0、1、2、4、8和16尾岩原鲤,平均体质量46 g。期间不喂食、不换水,共7 d。在实验第7天,从6个桶中分别采集1 L表层水样,每次取3个平行样本,用1 L无DNA蒸馏水作为阴性对照。

在500 L养殖桶中放入25尾岩原鲤,平均体质量46 g。养殖7 d结束后,第8天上午9:00将桶中的鱼捞出,在此后每天上午9:00采集1 L水样,每次取3个平行样本,连续采集30 d,1 L无DNA蒸馏水作为阴性对照。

提取eDNA

用津腾真空泵和0.45 μm孔径PTFE滤膜组合来过滤水样,将eDNA富集在滤膜上。将滤膜装入10 mL无菌EP管内,−20 °C保存。用HiPure Water DNA Kit水体DNA提取试剂盒 (Magen美基生物)参照说明书提取eDNA,设置空白在此过程中测试污染,采用分光光度法测定eDNA浓度。为了降低污染风险,采用无菌荧光设备、多手套更换和单独的专用实验室空间进行eDNA提取、PCR前和PCR后处理。

进行qPCR反应

反应体系和反应程序同“实时荧光定量PCR检测”,模板为1 μL eDNA样品。以不加模板的反应体系为阴性对照。绘制岩原鲤 DNA 拷贝数与其数量以及eDNA降解与时间之间的关系图,分别计算出相关系数 R2

2    结果

2.1    岩原鲤引物和荧光标记探针的选择

探针YYL-MGB1是一种寡核苷酸探针,其5'末端连接有荧光基团,3'末端有淬灭剂 (图1)。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,引物YYLF1/ YYLR1与岩原鲤mtDNA完成高温变性、低温复性延伸的热循环,并遵守聚合酶链式反应规律,同时加入的探针YYL-MGB1与岩原鲤mtDNA互补,在低温复性延伸阶段,反应体系中Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针YYL-MGB1酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可以接收荧光信号,即每有一条DNA链被扩增,就形成一个荧光分子,荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

图1 岩原鲤的mtDNA部分序列 Figure1. Partial sequence of mtDNA of P. rabaudi

2.2    检测特异性

使用来自鱼类的基因组DNA评估实时荧光定量PCR检测的特异性。经qPCR扩增,岩原鲤特异性引物YYLF1/YYLR1和探针YYL-MGB1对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,有强荧光信号增加,表现为阳性扩增,2尾岩原鲤DNA的扩增曲线参照图2,而供试的其余8种鱼类 (表3)和空白对照均未获得扩增信号,表现为阴性,样品扩增曲线参照图2。结果表明,该方法具有高度的特异性,可用于准确检测和区分岩原鲤。

图2 引物和探针对鱼类样品qPCR扩增结果示意图 Figure2. qPCR amplification of fish samples with primers and probes

2.3    提取DNA分析

从水体样本和鱼类肌肉中提取的DNA浓度分别为18~21和56~592 ng/µL。提取的eDNA纯度为1.7~2.1,肌肉DNA纯度为1.80~2.07。尽管有些DNA产量较低,但总体DNA纯度 (A260/A280)较高,这表明获得的DNA样本质量较高。

2.4    岩原鲤引物及探针的灵敏度及标准曲线

经实时荧光定量PCR测定,Ct值平均值分别为1号13.49、2号16.30、3号20.16、4号23.56、5号27.08、6号30.34、7号34.07。YYL质粒浓度50 ng/μL。所以,岩原鲤特异性探针YYL-MGB1的检测限位DNA浓度为50×10−7 ng/μL,即5×10−6 ng/μL。综上所述,引物-探针集显示了良好的检测极限,表明该引物-探针高度敏感。

根据Ct值对各稀释DNA初始浓度相对对数值拟合出岩原鲤12S rRNA基因qPCR标准曲线。标准曲线方程:Ct = −3.455LSQ + 46.582,其中LSQ为稀释浓度相对对数值 (为一个对数值,没有单位),Ct值是循环阈值,即达到设定最佳阈值时,每个反应管中的扩增轮数。拟合优度 (R2)=0.999 2,显示出良好的线性回归;曲线斜率 (k)为−3.455。该检测显示qPCR的效率为94.7%,使用公式E (%)= (10−1/k−1)×100%计算[20-21]

2.5    eDNA浓度和岩原鲤生物量的关系

根据扩增曲线Ct值判定岩原鲤的含量,0、1、2、4、8和16尾岩原鲤养殖缸中拷贝数分别为0、76 955.20、208 164.71、851 138.04、1 238 857.04和2 090 925.22个/L,得到岩原鲤DNA 浓度与其个体数量的相关性曲线:y = 131 546x + 77 623。阴性对照未检测到扩增。说明在上述条件下,从水环境中可有效提取到岩原鲤残留DNA,可被特异性地定量检测。而目标 DNA 浓度和岩原鲤数量有 R2 为0.957 的正相关性,说明岩原鲤数量越多,检测出的 DNA 量越多。

2.6    eDNA降解结果

检测结果显示,在岩原鲤去除后,水体中eDNA含量与时间负相关。第1天 (2020年12月26日)检测时水体eDNA拷贝数为1 102.81 拷贝/mL,而第17天 (2021年1月11日)检测时水体eDNA拷贝数降解为0.74 拷贝/mL。用幂函数拟合eDNA降解与时间之间的关系,拟合方程:y = 1 931.1x−2.935,相关系数R2 为0.941 (图3)。

图3 岩原鲤eDNA降解与时间的关系拟合 Figure3. Relationship fitting between degradation of eDNA and time in P. rabaudi

3    讨论

自2005年首次放流人工繁殖岩原鲤后,人工放流一直是岩原鲤资源保护的主要措施,连续十余年的人工放流对岩原鲤的资源恢复效果以及目前长江上游岩原鲤种群如何分布一直没有确切的科学证据。目前鱼类资源监测常用的方法是实地采样,然而岩原鲤样本采集困难,主要原因可能有2个,一是长江上游复杂的水文条件,二是岩原鲤资源衰退严重,濒临灭绝。国家计划从2020年起,在长江流域干流和重要通江湖泊全面禁渔,为期十年,因此采集鱼类样本会更加困难。另外,鱼类种群生物量估计通常需要对目标监测物种进行捕获,可能对生物栖息地造成影响,这既具有侵入性又成本昂贵[12]。长江上游地处长江经济带,在国家不搞大开发,共抓大保护的战略背景下,不破坏渔业资源和鱼类栖息地的渔业资源监测方式显得尤为重要。

环境DNA技术作为一种新的鱼类资源研究方法,不需要采集鱼类样本,只需要采集水环境样本,与传统采样方法相比,具有省时省力费用低、灵敏度高及环境友好,对调查对象无伤害等优点[15]。环境DNA (eDNA)为确定水生环境中物种的存在提供了一种辅助工具[22],并可能有助于渔业调查估计重要经济鱼类种群生物量[23-24]。eDNA通常在几小时至几周内降解成小片段[25-27],因此它被认为提供了关于物种在环境中存在的近似实时数据。

本研究结果显示,引物和 TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,表现为阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未获得扩增信号,表现为阴性。如果引物和数据库完备,基于eDNA的生物学监测可以不依赖于研究人员的分类识别技能[6]。对于靶向物种检测,采用聚合酶链式反应 (PCR),使用引物设计来特异性扩增部分目标DNA序列。传统的PCR已用于特异性eDNA检测。然而,定量 qPCR比传统的PCR技术具有明显的优势,因为添加了染料 (例如SYBR™Green)或标记的报告基因探针,可以通过qPCR仪器实时监测目标序列的扩增。定量根据标准曲线测量,与已知浓度参考DNA样本同时运行[28]。基于探针的qPCR增加了特异性和敏感性,因为使用具有正向和反向引物的探针可以确保有3个序列来检查目标模板DNA[29]。物种特异性分子标记可以从eDNA中通过PCR扩增,以便检测感兴趣的生物体,如濒危物种[30]和入侵物种[31]。此外,使用物种特异性探针 (例如MGB探针)来改进eDNA分析,与使用仅基于物种特异性引物或不使用MGB组的TaqMan®探针相比,将进一步增加物种特异性[32]。本实验采用MGB探针结合qPCR 的方法,qPCR 的阈值循环数与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数达到 0.999,检测限位DNA浓度为5×10−6 ng/μL,扩增效率为94.7%。结果表明在qPCR检测中加入探针可获得更大的特异性,对目的片段成功扩增,对非目的片段没有扩增,表明基于探针检测对目标物种eDNA样本最佳。

本实验发现目标eDNA浓度和岩原鲤数量具有的线性正相关性 (R2=0.957),岩原鲤DNA 浓度 (拷贝/L)与其个体数量的相关性曲线为:y = 131 546x + 77 623。本研究及其他研究已观察到eDNA浓度与水生物种的密度和生物量相关[33-34],这表明随着方法进一步细化,可从eDNA中估计物种相对丰度,为物种的保护和管理提供强有力的工具。然而鱼类密度与eDNA浓度之间并不总是存在一致的线性关系[35-37]。例如,河流系统中鲢的密度较低时,其生物量与eDNA浓度和检出率呈正相关,但在较大密度时趋于稳定[35]。因此,对该物种eDNA浓度的可靠种群估计目前仅限于鱼类密度较低的地区。最近的研究表明,结合生理异速生长尺度可以改善预测模型,使eDNA浓度可能成为鱼类丰度的可靠指标[17]。物种的特异性检测意味着开发对岩原鲤的eDNA测试方法是可行的,这将有助于为岩原鲤保护行动提供信息,以更好地了解岩原鲤分布和丰度;定期监测以研究岩原鲤种群随时间的变化;以及岩原鲤种群是否受到人类活动的影响。

去除岩原鲤后,水体中eDNA的拷贝数与时间呈负相关关系,其在环境中的存留时间为17 d左右。研究发现,eDNA 在水中可以从几天到几周检测到[38-39],这取决于各种环境因素。例如高温[40]和低pH[41]会加速eDNA降解,而紫外线辐射的影响在各研究之间结论不一,甚至相互矛盾[42]。此外,在物种生物量密度较高的环境中,eDNA衰减率较高[43]。这些非生物和生物因素有助于水中微生物活性和丰度的增加,从而间接影响eDNA的降解[40]。在对稀有或入侵物种监测时,对生物体特异性eDNA降解的研究是至关重要的[44]。在本研究中,发现岩原鲤eDNA的持久性达17 d左右。eDNA的短时间持久性为保护生物学开辟了新的视角,它可以获取物种的存在或缺失信息。关于DNA持久性的探索将极大地影响生物多样性研究和生物安全调查的规划。

对动物分布和丰度的监测是濒危物种保护工作的重要组成部分。然而,使用传统直接诱捕的侵入性监测方法会对小种群产生负面影响;使用非侵入性eDNA监测方法比传统采样方法高效[45]。本实验提供一种TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,建立了岩原鲤生物量评估的环境DNA检测技术,具有快速、灵敏、特异性的检测能力。该方法是实际应用中定量检测岩原鲤的附加工具,可为今后对岩原鲤的野外调查提供重要参考。

图1 岩原鲤的mtDNA部分序列 Figure1. Partial sequence of mtDNA of P. rabaudi
图2 引物和探针对鱼类样品qPCR扩增结果示意图 Figure2. qPCR amplification of fish samples with primers and probes
图3 岩原鲤eDNA降解与时间的关系拟合 Figure3. Relationship fitting between degradation of eDNA and time in P. rabaudi
表1 引物和探针 Table1 Primer and probe
名称
name
类型
type
长度/bp
length
引物/探针序列 (5′- 3′)
primer/probe sequence (5′-3′)
YYLF1 上游引物 forward primer 22 GAAGTGGGAAGAAATGGGCTAC
YYLR1 下游引物 reverse primer 18 GTGACGGGCGGTGTGTAC
YYL-MGB1 探针 probe 21 ATCATAGAACATCACGAACAT
表2 岩原鲤 TaqMan 探针与14种鱼类序列的比对结果 Table2 P. rabaudi TaqMan probe with comparison to the 14 kinds of fish DNA sequences
种名
species name
探针序列
probe sequence
岩原鲤
P. rabaudi
734 AT--CATAGAACATCACGAA-CAT 755

Carassius auratus
734 A---CATAGAATATTACGAA-CAT 755
黄颡鱼
Pelteobagrus fulvidraco
734 TACACATAGAATATTACGAATGA- 755
泥鳅
Misgurnus anguillicaudatus
734 TA--ATAAGAATATTACGGA-CA- 755
草鱼
Ctenopharyngodon idella
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755

Hypophthalmichthys molitrix
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755

Aristichthys nobilis
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755
麦穗鱼
Pseudorasbora parva
734 T---TATAGAATATTACGAATCAT 755

Cyprinus carpio
734 A---TATAGAATATTACGAA-CAT 755
长薄鳅
Leptobotia elongata
734 T---AATAGAATAACACGAA-CA- 755
齐口裂腹鱼
Schizothorax prenanti
734 TT--TATAGAATATTACGAA-CAT 755
青鱼
Mylopharyngodon piceus
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755
团头鲂
Megalobrama amblycephala
734 T---CACAGAACACTACGAA-CAT 755
乌原鲤
Procypris mera
734 G---CATAGAATATCACGAA-CAT 755
胭脂鱼
Myxocyprinus asiaticus
734 C---TGTAGAATAACACGAA-CA- 755
注:不匹配通过阴影突出显示
Notes: mismatches are highlighted by shading
表3 样品具体信息 Table3 Sample specific information
DNA 样品名称
DNA sample ID
种名
species name
样品采集地
sample locality
YYL 岩原鲤  P. rabaudi 四川省宜宾市
Yibin, Sichuan
JY 鲫 C. auratus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
HSY 黄颡鱼 P. fulvidraco 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
NQ 泥鳅 M. anguillicaudatus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
HS 黄鳝 Monopterus albus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
LY 鲢 H. molitrix 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
YY 鳙 A. nobilis 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
BDCWH 斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing
LiY 鲤 C. carpio 重庆市北碚区
Beibei,Chongqing

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基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估