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2020, 44(9): 1441-1447. doi: 10.11964/jfc.20190611828

鲤疱疹病毒Ⅱ型主要免疫原性蛋白的鉴定

1. 上海海洋大学,国家水生动物病原库,上海    201306

2. 上海海洋大学,水产科学国家级实验教学示范中心,上海    201306

3. 上海海洋大学,水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,上海    201306

通讯作者: 姜有声, ysjiang@shou.edu.cn

收稿日期:2019-06-06
修回日期:2019-09-17

基金项目:   国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-45-19);第四届中国科协青年人才托举工程(中国水产学会);上海海洋大学优秀本科生进实验室项目(2018) 

关键词: 鲤疱疹病毒Ⅱ型 , 免疫原性 , 蛋白 , 质谱鉴定

Identification of major immunogenic proteins from Cyprinid herpesvirus 2

1. National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals, Shanghai Ocean University, Shanghai    201306, China

2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai    201306, China

3. Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai Ocean University, Shanghai    201306, China

Corresponding author: Yousheng JIANG, ysjiang@shou.edu.cn

Received Date:2019-06-06
Accepted Date:2019-09-17

Keywords: Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) , immunogenicity , protein , mass spectrometry identification

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白,本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株(下简称CyHV-2)感染异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF),用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化,纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色后,用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示,透射电镜下观察发现50%~66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒,也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示,抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应,质谱鉴定显示,其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明,通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后,本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。

In order to obtain promising tools for improved diagnostics and new vaccine development, we purified Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) particles and identified more immunologic proteins in CyHV-2 particles by LC-MS. Firstly, the caudal fin of Carassius auratus gibelio (GiCF) cell line was infected with CyHV-2, and viral particles were purified from the cell supernatant by sucrose density gradient in combination with ultracentrifugation. The purified virions were observed by transmission electron microscope. Then the prepared purified virions were used to immunize mice to prepare an anti-CyHV-2 polyclonal antibody, and at the same time purified virions were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and stained with coomassie brilliant blue, and then subjected to Western blotting analysis and mass spectrometry identification using anti-CyHV-2 polyclonal antibody. Transmission electron microscope (TEM) results showed that a large amount of intact CyHV-2 virus particles were detected at 50%-66% sucrose density and virus particles without capsule were occasionally observed. Western blotting results showed that some protein bands had specific immunoreactivity with anti-CyHV-2 polyclonal antibody. 8 major immunogenic proteins were further identified as ORF92, ORF115, ORF25, ORF57, ORF66, ORF72, ORF131and ORF132 through mass spectrometry identification. Among them, ORF92, ORF66 and ORF72 are capsid proteins, and ORF115, ORF25, ORF131 and ORF132 are membrane proteins. The capsid protein and membrane protein of the virus play an important role in virus infection. In conclusion, the major immunogenic proteins of CyHV-2 virion were identified. This was fundamental and applied research on CyHV-2. Indeed, this knowledge is crucial for understanding the biology and pathogenesis of CyHV-2 infection and for facilitating the development of efficacious protein-based diagnostic methods and vaccine candidates.

鲫(Carassius auratus)养殖成本低,且养殖地域较广,在中国淡水养鱼业的养殖规模越来越大,其中最主要的养殖品种为异育银鲫(C. auratus gibelio)[1]。近几年来,由于疱疹病毒性造血器官坏死病(Herpesviral haematopoietic necrosis, HVHN)的暴发,对中国鲫养殖业的可持续发展造成了严重影响。鲫疱疹病毒性造血器官坏死病的病原为Ⅱ型鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2),该病毒又称金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV)[2],属鲤疱疹病毒科(Herpesviridae)[3]。Xu等[4]检测出CyHV-2病毒核衣壳呈六角形,直径110~120 nm,具有囊膜,囊膜直径170~200 nm,基因组全长290 304 bp,共编码约154个潜在开放阅读框(open reading frame, ORF)[5]。1995年Jung等[6]对CyHV-2进行了首次报道,提出该病毒是金鱼造血器官坏死病的致病病原,死亡率达到90%~100%。随后,多个国家和地区相继暴发,如今CyHV-2已在全世界范围内流行[7-10]

CyHV-2与鲤疱疹病毒Ⅰ型和Ⅲ型(CyHV-1和CyHV-3)都属于鲤疱疹病毒科。在过去的报道中,认为CyHV-1和CyHV-3感染的物种是鲤(Cyprinus carpio)和锦鲤,CyHV-2只感染金鱼,如今随着对鲤疱疹病毒的深入研究以及病毒的扩散,发现这3种鲤科疱疹病毒能够感染的鲤科物种比之前所知的更广泛[9, 11-12]。其中,CyHV-1和其他2种病毒比较起来危害性较小,所以鲜有报道。CyHV-3也称锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)[13],KHV导致世界各地的锦鲤和鲤大量死亡,因此得到了国际的关注,关于KHV的主要免疫原性蛋白以及毒力基因都有相关的研究[14-15]。但是目前关于CyHV-2蛋白的研究却非常有限。其中,有一些学者利用CyHV-2蛋白进行了免疫学检测方法的研究,利用ORF92编码的衣壳蛋白制备的单克隆抗体在实验中可以有效地运用免疫学检测方法对感染CyHV-2的细胞和组织进行鉴定[16],Kong等[17]利用ORF72建立了一种CyHV-2的免疫学检测方法。也有研究证明了一些CyHV-2蛋白具有免疫原性,周勇等[18]利用ORF25进行原核表达的截短蛋白tORF25具有较好的免疫原性,ORF72编码的衣壳蛋白也被证实是一种有效的病毒免疫原[19],也有研究发现ORF5具有免疫原性[20]。但是目前还没有研究对CyHV-2的主要免疫原性蛋白进行过集中鉴定。

本研究采用20%~66%蔗糖密度梯度超速离心法对CyHV-2病毒进行纯化,免疫小鼠(Mus musculus)制备抗CyHV-2多克隆抗体,纯化的病毒经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色后运用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析,结合质谱分析鉴定出CyHV-2的主要免疫原性蛋白,为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的制备提供更多的候选抗原。

1    材料与方法

1.1    实验材料

CyHV-2-YC-1毒株(下简称CyHV-2)为本实验室保存毒株,取自自然发病鲫;异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF)[21]由本实验室建立;4周龄BABL/c雌性小鼠购自上海雷根生物科技有限公司。

蔗糖购自Sigma公司;SDS-PAGE配胶试剂、蛋白Marker、凝胶电泳缓冲液、转膜缓冲液和ECL化学发光显色液购自上海天能科技有限公司;HRP标记的羊抗小鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2    实验方法

病毒增殖与纯化

用CyHV-2感染GiCF细胞,将出现明显细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的细胞感染液进行1~2次冻融处理,于4 °C下4 000 r/min离心20 min,底部沉淀为细胞碎片,收集上清液于4 °C下32 000 r/min离心1.5 h,弃上清液,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)重悬沉淀;将病毒悬液加入由质量体积比分别为20%、30%、40%、50%和66%的蔗糖密度梯度离心管上层,于4 °C下25 000 r/min离心1 h;收集每一层的病毒样品于不同试管中,每管中加入少量无菌水,上层加入20%蔗糖溶液,于4 °C下32 000 r/min离心2 h,收集每一管沉淀,用无菌水重悬,标记好每一层的病毒颗粒,将每一层纯化的病毒颗粒分别吸附于铜网上,3%的磷钨酸(pH 7.2~7.4)负染2 min,待铜网烘干后在透射电子显微镜下观察。

抗CyHV-2多克隆抗体制备

经纯化的CyHV-2病毒颗粒作为免疫原,免疫4周龄的BABL/c雌性小鼠,分4次进行免疫,每次腹腔注射200 μL/只。第1次免疫将CyHV-2病毒颗粒与弗氏完全佐剂等体积混合反复吹吸直至完全乳化后注射,第2次与第3次采用弗氏不完全佐剂完全乳化后注射,第4次采用纯抗原注射,第2次免疫在第1次免疫的2周后,第3次和第4次免疫分别在上一次免疫的1周后。通过小鼠眼角取血,血液在37 °C放置1 h后,4 °C过夜待血液分层,8 500 r/min离心2 min获得透明的淡黄色上清液即为抗CyHV-2多克隆抗体。

SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色

配制由12%的分离胶和5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶,将纯化好的病毒与2×蛋白上样缓冲液按1∶1的比例混匀后在沸水中水浴5 min,冷却后点样进行电泳(80 V,20 min后120 V,80 min)。电泳结束后,其中一块凝胶用考马斯亮蓝染色液染色1~2 h后用脱色液进行脱色,直至凝胶上的条带清晰可见时用凝胶成像仪进行拍照。

Western blotting

将上述SDS-PAGE分离后的另一块凝胶用湿转的方法(100 V,70 min)转移至硝酸纤维素(NC)膜上,然后用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h;1∶1 000稀释的抗CyHV-2多克隆抗体4 °C下孵育过夜,PBST缓冲液(含有0.1%的吐温-20的PBS溶液)洗膜4次,每次5 min;1∶4 000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG室温孵育1 h,用0.1%的PBST洗膜7次,每次5 min,将NC膜在ECL化学发光显色液中浸泡1 min后,用成像仪进行曝光拍照。

质谱鉴定

通过比对考马斯亮蓝脱色后的凝胶与ECL化学发光显色后的NC膜,将与NC膜显色明显条带相应位置的考马斯亮蓝脱色凝胶小心切出,进行胶内酶解,运用液相色谱—串联质谱法 (LC-MS/MS)进行质谱分析。原始数据在NCBI数据库中检索。

2    结果

2.1    病毒纯化

与正常的细胞相比,GiCF细胞在CyHV-2感染后的3 d左右出现CPE,此时细胞开始拉长,死亡,从培养瓶壁脱落,在感染8 d左右出现明显CPE,细胞有90%以上已经死亡(图版Ⅰ)。此时收集细胞感染液进行病毒纯化。

图版Ⅰ CyHV-2感染异育银鲫尾鳍细胞 Plate1. GiCF cells infected with CyHV-2

蔗糖密度梯度超速离心后可见3条清晰的病毒条带(图1)。

图1 CyHV-2蔗糖密度梯度超速离心纯化结果 Figure1. Results of CyHV-2 purification by sucrose density gradient ultracentrifugation

病毒纯化后经透射电镜观察发现,20%~30%、30%~40%和40%~50%密度的蔗糖中杂质较多,少见病毒颗粒;50%~66%密度的蔗糖收集到大量的病毒,多为完整的病毒颗粒,也有一些囊膜破损的病毒颗粒。完整的CyHV-2病毒颗粒呈圆形,有囊膜包裹;囊膜破损的病毒颗粒形态呈圆形,囊膜部分呈现为透亮的一圈,CyHV-2病毒颗粒直径为110~120 nm(图版Ⅱ),与之前的报道一致[4]

图版Ⅱ 透射电镜下纯化的CyHV-2颗粒 Plate2. Purified particles of CyHV-2 under transmission electron microscope

2.2    SDS-PAGE和Western blotting

对纯化的病毒进行SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色并脱色后的凝胶用成像仪拍照可以看到许多丰度不一的蛋白条带(图2-a)。凝胶湿转后的NC膜以抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析,成像仪曝光拍照结果显示,多条蛋白能够与抗CyHV-2多克隆抗体识别并发生特异性免疫反应,其中8条具有明显特异性免疫反应的蛋白分别为ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132,其分子量分别为140、84、66、64、45、41、35和17 ku(图2-b)。

图2 纯化的CyHV-2病毒SDS-PAGE电泳(a)和Western blotting结果(b) Figure2. Results of SDS-PAGE of purified CyHV-2 virions (a) and Western blotting analysis (b)

2.3    质谱分析

将其中8条具有明显特异性免疫反应的蛋白胶条切割下来进行质谱分析。鉴定结果显示,ORF92、ORF66和ORF72定位为核衣壳,其中,ORF92(YP_007003911.1)为主要衣壳蛋白,ORF66(YP_007003885.1)和ORF72(YP_007003891.1)为衣壳三重联体蛋白。ORF115(YP_007003933.1)、ORF25(YP_007003844.1)、ORF131(YP_007003952.1)和ORF132(YP_007003951.1)定位为囊膜,为膜蛋白。ORF57(YP_007003878.1)为未知蛋白(图2-b表1)。

表1 CyHV-2主要免疫原性蛋白LC-MS/MS鉴定 Table1. Identification of major immunogenic proteins from CyHV-2 by LC-MS/MS
序号
no.
蛋白
protein
蛋白编号
accession
分子质量/ku
mass
可信度
−10lgP
总肽段总数
peptides
定位
localization
蛋白描述
description
1 ORF92 YP_007003911.1 140 447 67 核衣壳
nucleocapsid
主要衣壳蛋白
major capsid protein
2 ORF115 YP_007003933.1 84 245 13 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
3 ORF25 YP_007003844.1 66 155 5 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
4 ORF57 YP_007003878.1 64 348 32 未知
unknown
未知蛋白
unknown protein
5 ORF66 YP_007003885.1 45 309 24 核衣壳
nucleocapsid
衣壳三重联体蛋白1
putative capsid triplex subunit 1
6 ORF72 YP_007003891.1 41 324 17 核衣壳
nucleocapsid
衣壳三重联体蛋白2
putative capsid triplex subunit 2
7 ORF131 YP_007003952.1 35 87 2 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
8 ORF132 YP_007003951.1 17 150 4 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
注:蛋白可信度得分,值越大表明该蛋白包含的可信肽段越多
Notes: −10lgP, a larger value indicates that the protein contains more reliable peptides
表1 CyHV-2主要免疫原性蛋白LC-MS/MS鉴定
Table1. Identification of major immunogenic proteins from CyHV-2 by LC-MS/MS

3    讨论

CyHV-2病毒对水产养殖业构成的重大威胁和造成的巨大经济损失已经不容小觑[22]。为了更好地应对CyHV-2的暴发,首先要建立有效的检测方法,目前对于CyHV-2病毒的检测方法有很多种,比较成熟的有细胞培养技术、PCR技术[23]和环介导等温检测技术[24]等,但是基于免疫学的检测方法还尚未成熟,本实验鉴定的8个主要免疫原性蛋白可以为CyHV-2的免疫学检测方法的建立提供更多的候选抗原。

相对来说,预防是有效控制病害侵入的关键,因此疫苗的研制十分重要,但是目前关于预防CyHV-2疫苗的研究十分有限,其中,有研究揭示了ORF104在CyHV-2感染过程中的作用,也表明ORF104是CyHV-2的潜在候选疫苗[25],基于酵母源的ORF25家族也被开发为CyHV-2潜在候选疫苗[26]。相对CyHV-2目前带来的损失,仅有这些研究是不够的,因此开发一种安全有效的CyHV-2疫苗仍然是一项高度优先具有挑战性的研究,本实验鉴定的CyHV-2的主要免疫原性蛋白可以为疫苗的研制提供更多的主要靶点。

在2013年,Davison等[27]的研究中提到CyHV-2基因组预计包含150个功能蛋白。其中,本研究最终鉴定结果显示的8个具有主要免疫原性的蛋白分别为ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。ORF92、ORF66和ORF72是衣壳蛋白,且ORF66是首次发现的具有免疫原性的衣壳蛋白,病毒衣壳蛋白具有良好的抗原性,能够诱发机体的体液免疫与细胞免疫。因此,衣壳蛋白在CyHV-2病毒的研究中能够发挥巨大的作用。ORF115、ORF25、ORF131和ORF132是囊膜蛋白,目前除了ORF25外,其他几个囊膜蛋白都没有被研究过,病毒囊膜蛋白的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞,囊膜在识别宿主、侵入宿主细胞和病毒的抗原性方面起重要作用,因此,本研究鉴定的几个囊膜蛋白能够为CyHV-2感染宿主过程的研究提供更多的依据。且有研究表明,CyHV-2与CyHV-3的同源性高达81.55%[28],本研究鉴定的CyHV-2的主要免疫原性蛋白对于CyHV-3的研究也有一定的帮助。此外,蛋白在病毒中含量的高低会影响蛋白的鉴定,CyHV-2中ORF5和ORF104的含量可能相对较低,因此在本实验中没有鉴定出。

综上所述,本实验采用蔗糖密度梯度超速离心法成功提纯了CyHV-2病毒,证明了通过体外感染细胞进而提纯病毒的方法可行,并成功制备了抗CyHV-2多克隆抗体,通过对纯化CyHV-2病毒颗粒进行Western blot分析,经LC-MS/MS鉴定结果表明,ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132为主要免疫原性蛋白,丰富了CyHV-2免疫原性蛋白数量,并且为下一步研究提供了思路。本课题组下一步计划筛选其中几个蛋白,研究其在表达过程中的时序性,进而对CyHV-2更全面深入的研究提供更多的理论依据。

图版Ⅰ CyHV-2感染异育银鲫尾鳍细胞 Plate1. GiCF cells infected with CyHV-2
图1 CyHV-2蔗糖密度梯度超速离心纯化结果 Figure1. Results of CyHV-2 purification by sucrose density gradient ultracentrifugation
图版Ⅱ 透射电镜下纯化的CyHV-2颗粒 Plate2. Purified particles of CyHV-2 under transmission electron microscope
图2 纯化的CyHV-2病毒SDS-PAGE电泳(a)和Western blotting结果(b) Figure2. Results of SDS-PAGE of purified CyHV-2 virions (a) and Western blotting analysis (b)
表1 CyHV-2主要免疫原性蛋白LC-MS/MS鉴定 Table1 Identification of major immunogenic proteins from CyHV-2 by LC-MS/MS
序号
no.
蛋白
protein
蛋白编号
accession
分子质量/ku
mass
可信度
−10lgP
总肽段总数
peptides
定位
localization
蛋白描述
description
1 ORF92 YP_007003911.1 140 447 67 核衣壳
nucleocapsid
主要衣壳蛋白
major capsid protein
2 ORF115 YP_007003933.1 84 245 13 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
3 ORF25 YP_007003844.1 66 155 5 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
4 ORF57 YP_007003878.1 64 348 32 未知
unknown
未知蛋白
unknown protein
5 ORF66 YP_007003885.1 45 309 24 核衣壳
nucleocapsid
衣壳三重联体蛋白1
putative capsid triplex subunit 1
6 ORF72 YP_007003891.1 41 324 17 核衣壳
nucleocapsid
衣壳三重联体蛋白2
putative capsid triplex subunit 2
7 ORF131 YP_007003952.1 35 87 2 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
8 ORF132 YP_007003951.1 17 150 4 囊膜
envelope
膜蛋白
membrane protein
注:蛋白可信度得分,值越大表明该蛋白包含的可信肽段越多
Notes: −10lgP, a larger value indicates that the protein contains more reliable peptides

参考文献

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鲤疱疹病毒Ⅱ型主要免疫原性蛋白的鉴定